TRAIL联合顺铂诱导胶质瘤细胞凋亡的机制

严 海 齐 玲金 宏赵东海温 娜于洪泉

(北华大学第二附属医院脑外科，吉林 吉林 132022)

TRAIL联合顺铂诱导胶质瘤细胞凋亡的机制

严 海 齐 玲1金 宏1赵东海1温 娜1于洪泉2

(北华大学第二附属医院脑外科，吉林 吉林 132022)

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体;顺铂;脑质瘤

作为新型的抗肿瘤药物，肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)已进入临床Ⅱ期试验阶段〔1〕。研究发现，TRAIL可以诱导包括胶质瘤在内的多种肿瘤细胞发生凋亡，但大多恶性胶质瘤细胞对TRAIL耐药〔2〕。前期研究的实验发现，原代培养的胶质瘤细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感性不同，检测发现死亡受体(DR)5的表达量不同，并当TRAIL与化疗药物联合作用后可发挥协同作用〔3～5〕。因此，本文进一步对TRAIL与化疗药物联合作用诱导胶质瘤细胞凋亡的机制进行研究，为TRAIL作为肿瘤治疗新药提供新的实验依据。

1 材料与方法

1.1 试剂 小牛血清、DMEM/F12培养基、0.25%胰酶(Gibco公司);rhTRAIL(Peprotech 公司);顺铂(cisplatin，Sigma公司);鼠抗人Caspase-8单克隆抗体(Cell Signaling公司);兔抗人肌动蛋白(Actin)多克隆抗体(Sigma公司);过氧化物酶标记羊抗鼠(兔)IgG第二抗体(Jackson Immunoresearch公司)。

1.2 细胞培养 从-80℃冰箱中取出冻存的早期原代恶性胶质瘤 GC125 细胞〔4，6〕，复苏后离心弃上清，重悬细胞，将细胞接种于25 cm2培养瓶中，加入10%DMEM/F12培养液，将培养瓶置入37℃、5%CO2孵箱、饱和湿度下进行培养，隔日换液，1∶3传代。

1.3 Western印迹检测药物作用后恶性胶质瘤细胞凋亡情况〔3〕将细胞分为四组，分别为对照组(不加药物)、TRAIL组(300 ng/ml)、联合用药组(TRAIL 300 ng/ml+顺铂10 μg/ml)、顺铂组(10 μg/ml)。待细胞生长90%左右，加入药物作用3 h。收集细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)充分洗涤，3 000 r/min离心5 min弃上清。PBS再次充分洗涤细胞，离心弃上清，每个样品加入50 μl的细胞裂解液，细胞充分裂解后，12 000 r/min 4℃离心15 min，上清移于另一管中，弃沉淀，Braford法检测样品蛋白浓度，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)跑胶分离样品，4℃转膜封闭后，加入一抗4℃孵育过夜。加入相应的二抗，室温、避光孵育1 h，胶片曝光拍照。

2 结果

加入TRAIL和(或)顺铂后观察GC125细胞发生凋亡反应情况。在联合用药组可见到明显的凋亡小体，并且随着作用时间的增加，细胞发生凋亡的数量明显增多;在药物作用于细胞3 h后提取蛋白，每孔加入80 μg蛋白，跑胶分离蛋白，并加入Caspase-8抗体。曝光后可见到细胞发生Caspase-8裂解反应。见图1。

图1 恶性胶质瘤GC125细胞经TRAIL联合顺铂作用后发生凋亡级联裂解反应的情况

3 讨论

美国脑肿瘤注册中心2008年统计结果显示，恶性胶质瘤占原发性恶性脑肿瘤的70%，年发病率为5/100 000，每年新发病例超过14 000例。但由于恶性胶质瘤在脑内呈弥散分布〔7〕，故手术难以清除。这可能是由于激活细胞生长途径和(或)抑制细胞凋亡途径而对治疗抵抗〔8〕。作为研究的热点，TRAIL虽可以诱导多种肿瘤细胞发生凋亡，但却存在着耐药现象，迄今为止，科研人员还在对攻克这一难题做着不懈的努力。

TRAIL作用于细胞后与细胞表面的DR5结合，再通过胞内受体的死亡结构域(DD)募集胞内特异性的凋亡相关因子(FAS)相关死亡结构域(FADD)，FADD上的死亡效应域(DED)又募集Caspase-8前体，通过装配成DR5-FADD-Caspase-8死亡诱导信号复合体(DISC)激活Caspase-8，引发凋亡级联裂解反应，使细胞发生凋亡〔9〕。Caspase-8有两种同分异构体P55和P53，通过DED，Caspase-8被FADD募集到DISC，经两步自体蛋白水解过程释放P18、P10两个亚单位，Caspase-8发生活化裂解引起细胞凋亡。

本实验对恶性胶质瘤GC125细胞进行研究，应用TRAIL与顺铂分别或联合作用于细胞后，经Western印迹检测显示，对照组与顺铂组均未见明显的Caspase-8凋亡级联裂解反应，TRAIL组可见到少量的Caspase-8二步裂解产物P18片段，联合用药组则可见到明显的P18裂解片段。初步说明TRAIL与顺铂联合作用后，可增强TRAIL的诱导凋亡作用，使恶性胶质瘤细胞发生凋亡，这可能是通过增加细胞Caspase-8活化而引起。但恶性胶质瘤发生TRAIL耐药的机制，还需进一步研究。

1 Bellail AC，Qi L，Mulligan P，et al.TRAIL agonists on clinical trials for cancer therapy:the promises and the challenges〔J〕.Rev Recent Clin Trials，2009;4(1):34-41.

2 Li YC，Tzeng CC，Song JH，et al.Genomic alterations in human malignant glioma cells associate with the cell resistance to the combination treatment with tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand and chemotherapy〔J〕.Clin Cancer Res，2006;12(9):2716-29.

3 南栗岩，齐 玲，肖振晶，等.原代培养的恶性胶质瘤细胞表达死亡受体与TRAIL抵抗的关系〔J〕.中国老年学杂志，2011;31(18):3591-2.

4 严 海，张 宇，于洪泉，等.肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体对胶质瘤细胞的诱导凋亡作用〔J〕.中国实验诊断学，2011;15(8):1355-6.

5 金 宏，张 宇，于洪泉，等.坏死因子相关凋亡诱导配体联合化疗药物对胶质母细胞瘤细胞的杀伤作用〔J〕.中风与神经疾病杂志，2011;28(7):639-40.

6 齐 玲，金 宏，丁丽娟，等.脑肿瘤干细胞的培养及生物学特性研究〔J〕.中国实验诊断学，2011;15(2):227-8.

7 Holland EC，Glioblastoma multiforme:the terminator〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2000;97(12):6242-4.

8 Smyth MJ，Takeda K，Hayakawa Y，et al.Nature's TRAIL-on a path to cancer immunotherapy〔J〕.Immunity，2003;18(1):1-6.

9 Bellail AC，Tse MC，Song JH，et al.DR5-mediated DISC controls caspase-8 cleavage and initiation of apoptosis in human glioblastomas〔J〕.J Cell Mol Med，2010;14(6A):1303-17.

〔2012-01-18收稿 2012-02-10修回〕

(编辑 袁左鸣)

R739.41

A

1005-9202(2012)17-3751-02;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.17.062

吉林省自然科学基金(No.202015242);吉林省教育厅项目(No.2012330，2011281);吉林医药学院留学归国博士科研启动基金(No.201101)

1 吉林医药学院病理教研室 2 吉林大学第一临床医院神经外科

于洪泉(1974-)，男，博士，主治医师，主要从事脑胶质瘤综合治疗研究。

严 海(1974-)，男，主治医师，主要从事脑肿瘤药物治疗研究。