在模拟体系中研究发酵条件对红葡萄酒中白藜芦醇含量的影响

任 健，师俊玲

（西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西杨凌712100）

在模拟体系中研究发酵条件对红葡萄酒中白藜芦醇含量的影响

任 健，师俊玲*

（西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西杨凌712100）

以陕西省泾阳产赤霞珠葡萄为原料，通过二次正交旋转实验设计，研究了模拟体系中初始pH、SO2、温度以及酒精度对葡萄中白藜芦醇溶出的影响，建立了各因素影响的回归方程，并对其进行了响应曲面分析，建立了预测模型。关键词：葡萄酒，浸渍，白藜芦醇，影响，响应面

白藜芦醇是植物体内天然的二苯乙烯类多酚物质（3，4’，5-三羟基二苯乙烯），是葡萄酒中重要的生物活性物质，具有预防和减少一系列疾病和延长生物体寿命等作用[1-5]。除非微生物发酵过程或葡萄中组分反应能够产生新的白藜芦醇，葡萄酒中白藜芦醇的最终含量水平实际上是葡萄中白藜芦醇的浸出程度及其在酒中稳定性的综合反映。葡萄酒的酿造过程实际上是一个分批发酵的过程，在这一过程中，酒醪中的酒度、糖度、温度、酸度等因素都会处于不断变化的状态，这种变化会直接影响到葡萄中白藜芦醇的浸出量和稳定性。掌握各种条件对酒中白藜芦醇含量的影响规律对于及时终止发酵和控制发酵过程向有利于提高酒中白藜芦醇含量的方向发展有重要意义。葡萄果实中白藜芦醇含量水平是决定葡萄酒中白藜芦醇含量的主要因素。它主要与葡萄品种、栽培方式、生态条件、环境胁迫等条件有关[6]。在酵母中转入白藜芦醇合成过程的关键酶基因可以在发酵过程中生成一定的白藜芦醇[7]；通过对葡萄进行采后短期缺氧和冷冻处理也能提高葡萄中白藜芦醇含量[8]。此外，发酵过程中所用的酵母菌种、葡萄品种和生产年份、SO2和果胶酶的添加以及澄清剂的使用对葡萄酒中白藜芦醇含量产生一定影响[9-14]，但有关这种现象的产生机制并不清楚。就理论分析，在葡萄原料确定的条件下，除非与白藜芦醇发生反应，这些因素对酒中白藜芦醇含量的影响主要是通过酒醪特性的改变来影响白藜芦醇浸出量和稳定性从而实现的。关于葡萄酒酿造过程中与白藜芦醇有关的化学反应尚未见报道。为了探讨发酵过程中的主要因素对葡萄酒中白藜芦醇含量的影响机制，本文重点考察了pH、SO2添加量、酒精度和温度对葡萄中白藜芦醇溶出量的影响，并通过单因素实验和二次正交旋转实验，结合响应面分析方法（RSM）对这些指标水平进行了优化，以期获得能够使白藜芦醇最大量地进入葡萄酒中的最优条件，从而为红葡萄酒的酿造过程提供理论参考；并在白藜芦醇浸出量的角度上阐明主要酿造条件影响葡萄酒中白藜芦醇含量的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

赤霞珠葡萄 于2009年9月采于陕西泾阳县；白藜芦醇标品 购于中国药品生物制品检定所；甲醇 色谱纯；H2SO3、HCl、NaOH、乙醇等 均为市售分析纯。

Waters600E高效液相色谱仪 美国waters；ZSD-1160培养箱 上海智诚分析仪器制造有限公司；旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；T-203电子天平 美国丹佛；pH-3C酸度计 上海精密科学仪器有限公司；高压液相色谱仪 美国Waters，配有C18柱（5μm，250mm× 4.6mm）和UV检测器。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理 挑选同批采摘、颜色大小相近、完熟的赤霞珠葡萄为原料，破碎后对其称重、测体积，在－40℃下冷冻保存，用作实验原料。

1.2.2 单因素实验设计 称取葡萄100g左右准确称重，破碎后置于三角瓶中，在维持其他条件不变的条件下，分别改变温度、pH、酒精度和SO2浓度，考察各因素对葡萄浸出的葡萄汁液中白藜芦醇含量的影响。当一个因素变化时，其他因素的水平分别固定为：温度28℃，pH3.2，酒精度0°，SO2浓度0mg/L。各因素变化范围为：温度：12、20、28、32℃；初始pH：2.8、3.2、3.5、4.0；酒精度：0°、7°、12°、16°；SO2浓度：30、60、90、120mg/L。其中，pH用NaOH进行调节，酒精度用无水乙醇进行调节，SO2浓度用H2SO3溶液进行调节。在不同条件下处理17h后，混合均匀后取汁液部分测定其中的白藜芦醇含量。

1.2.3 二次正交旋转实验设计 根据单因素实验结果，选取pH、SO2浓度、酒精度和温度的考察水平，用Design－Expert 7.00软件，按照可旋转的中心组合设计方法设计实验方案，因素水平见表1。

表1 二次正交旋转实验设计因素水平编码表Table 1 Codes of the factors and levels in the central composite design

1.2.4 白藜芦醇含量的测定 参照文献[15－16]，以及GB/T15038－2005葡萄酒、果酒通用分析方法附录中[17]有关白藜芦醇含量的测定方法进行样品前处理。具体方法为：取葡萄酒醪20.0mL，加入2.0g NaCl溶解后，再加20.0mL乙酸乙酯振荡萃取30min，分出有机相，加入3.0g无水硫酸钠除去其中的水分，重复一次，在50℃水浴中真空蒸发，真空度为0.06～0.08MPa。加2.0mL甲醇溶解剩余物，移到离心管中置于冰柜中冷冻待测。以上所有操作应尽量在避光的条件下进行。采用外标法用液相色谱法测定其白藜芦醇含量，所用色谱柱为C18柱（5μm，250×4.6mm），流动相为乙腈∶水=30∶70，进行等压洗脱，流速为1.0mL/min，检测波长为306nm，进样量为20μL。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 初始pH的影响 葡萄果实的pH在成熟过程会从2.8升到3.5或者更高，葡萄酒进行苹果酸－乳酸发酵时的pH在3.1～3.4之间[18]。为了结合实际生产情况，本文主要考察了pH在2.8到4.0之间变化时，葡萄中白藜芦醇向酒醪中的浸出情况。结果发现（图1），酒醪中的白藜芦醇含量随着pH的变大先略有减小，至pH3.5时降到最低值2.30mg/L；此后，随着pH的增大，白藜芦醇含量有所增加，至pH4.0时达到最大的4.26mg/L。这说明，较高的pH有利于葡萄中白藜芦醇的溶出。但是，高pH会导致酒醪容易染菌；而且，酿酒的葡萄自然pH均较低，加工过程中SO2的加入会使酒醪pH进一步降低，在现有工艺条件下要使酒醪控制在较高的pH水平是不切实际的。

图1 pH对白藜芦醇溶出的影响Fig.1 Effect of pH on resveratrol content in dissloution

2.1.2 酒精度的影响 在葡萄酒的酿造过程中，随着酿造过程的进行，酒醪中的酒精度会不断升高。在现有工艺条件下，葡萄酒的最终酒精度一般在7°至16.2°之间。为此，本文重点考察了酒精度在7°至16.2°之间变化时，酒醪中白藜芦醇含量的变化情况。结果发现（图2），随着酒精度的增大，酒醪中白藜芦醇含量明显增大；当酒精度从0°增大至16°时，酒醪中白藜芦醇含量由2.51mg/L增大至9.24mg/L。这说明，较高的酒精度有利于葡萄中白藜芦醇的溶出；这与白藜芦醇提取时需要较高的酒精浓度相一致，也是白藜芦醇易溶于酒精的特性所决定的[19]。因此，在葡萄酒的酿造过程中，维持较高的酒精度，有助于提高酒中白藜芦醇的最终含量。

图2 酒精度对白藜芦醇溶出的影响Fig.2 Effect of alcoholic strength on resveratrol content in dissloution

图3 SO2对白藜芦醇溶出的影响Fig.3 Effect of sulfur dioxide on resveratrol content in dissloution

2.1.3 SO2浓度的影响 在葡萄酒的酿造过程中，通常需要加入SO2防止氧化反应和抑制其它杂菌的生长。一般情况下，根据葡萄果实中含酸量的高低，葡萄酒酿造过程中SO2的使用量通常在30～80mg/L之间；破损霉变的果实较多时，SO2添加量在80～100mg/L之间[20]。SO2的添加量较高时，会抑制乳酸菌的生长，对苹果酸－乳酸发酵过程不利[20]。考虑到食品卫生安全问题，本文重点研究了SO2添加量在30mg/L至120mg/L之间变化时，酒醪中白藜芦醇含量的变化情况。结果发现（图3），酒醪中白藜芦醇含量呈现2.5mg/L至3.7mg/L的波动，与SO2的添加量间未表现出明显的规律关系。

2.1.4 温度的影响 大量研究结果表明，红葡萄酒的最佳发酵温度为26～30℃，苹果酸－乳酸发酵的最佳温度为18～20℃[21]。温度高于32℃时，酵母繁殖速度下降，酵母疲劳。结合葡萄酒酿造时的温度条件，本文重点考察了温度在12℃至32℃之间变化时，酒醪中白藜芦醇含量的变化情况。结果显示（图4），酒醪中白藜芦醇含量在温度低于20℃时无显著变化，但当温度从20℃升至32℃时则出现显著增加。这说明，升高温度有利于葡萄中白藜芦醇的溶出。但是，在实际生产过程中，升高温度会引起杂菌的滋生和热敏性物质的破坏与损失，而且会导致香气成分的逸失。因此，在实际生产过程中，一味地提高酿造温度也是不可取的。

图4 温度对白藜芦醇溶出的影响Fig.4 Effect of temperature on resveratrol content in dissloution

2.2 二次正交旋转实验结果

除酒精度的影响实验以外，上述单因素实验结果都是在酒醪中酒精度为0的条件下进行的。所得结果不能体现葡萄酒酿造过程中酒精度不断升高的实际情况，也不能反映各因素之间交互作用的影响。为了进一步摸清各因素对酒醪中白藜芦醇含量的综合影响，本文在单因素实验结果的基础上，将实验条件进一步扩大，以初始pH4.5、SO2浓度60mg/L、酒精度10°、温度25℃为中心点，按照二次正交旋转设计进行实验，实验结果如表2所示。用Design－Expert 7.00对表2中所得数据进行回归分析，可得以白藜芦醇含量为因变量的函数关系，如方程（1）和方程（2）所示。对回归模型进行方差分析，结果如表3所示。

采用水平代码所得回归方程为：

采用实际值所得回归方程为：

表2 二次正交旋转实验设计方案及结果Table 2 Central composite experimental design and results

表3 二次响应面模型方差分析和回归模型系数显著性检验Table 3 Analysis of variance and significance of the response surface quadratic regression model

由表3可以看出，所得回归模型达极显著水平（P＜0.0001），R2=0.8876，说明仅有11.2%变异的不能由该模型解释。模型中的因素C（酒精度）、D（温度）和C2达到了极显著水平；A和B的影响不显著（p＞0.1）。

由方程1中各因素对应的回归系数绝对值可以看出，各因素一次项对白藜芦醇含量的影响次序为C＞D＞A＞B，即酒精度的影响最大，其次为温度、pH，SO2添加量的影响最小。

固定方程1中三个因素为零水平，可得出另一因素对白藜芦醇的影响规律，如图5所示。由图5可以看出，当其它因素固定不变时，酒醪中白藜芦醇含量随着因素D（温度）的增大呈直线上升，随着因素C（酒精度）的增大呈指数上升，随着因素A（pH）和因素B（SO2添加量）的增大呈二次抛物线上升。此处所得结果中，除了温度和酒精度的影响与单因素实验结果比较吻合以外，pH和SO2添加量的影响规律与单因素实验结果不符。这是因为，前述单因素实验中各因素的0水平与此处有所不同。这也说明，各因素的影响之间存在着较强的交互作用。

图5 实验中不同因素对白藜芦醇含量影响的回归曲线Fig.5 Contours plots of factors on resveratrol content in design

图6 温度和酒精度对白藜芦醇溶出的影响Fig.6 Response surface（3D）showing the effect of temperature and alcohol on resveratrol dissloution

图7 温度和SO2对白藜芦醇溶出的影响Fig.7 Response surface（3D）showing the effect of temperature and SO2on resveratrol dissloution

使用Design－Expert 7.00软件对正交旋转实验中交互作用达显著水平几个因素作响应曲面分析，结果如图6～图8所示。由图可以看出两个因素同时变化时对响应值的影响趋势，但是，在本文所考察的因素水平范围内，这些响应曲面并未出现峰值区间。这说明，在现有的葡萄酒生产工艺条件下，无论怎么组合，也达不到使酒中白藜芦醇含量达到最高值的理想条件。但是，由此可以看出，维持较高的发酵温度和酒精度，或者在葡萄酒酿造过程中保持pH和SO2添加量在实验数值范围以内，均能使酒中白藜芦醇含量达到较高的水平。

图8 温度和pH对白藜芦醇溶出的影响Fig.8 Response surface（3D）showing the effect of temperature and pH on resveratrol dissloution

3 结论与讨论

本实验在单因素实验结果的基础上，采用二次旋转正交实验方案考察了初始温度、SO2添加量、酒精度以及初始pH对葡萄酒糟中白藜芦醇溶出的影响；利用响应面分析方法建立了各因素对白藜芦醇溶出的二次多项式模型，对模型进行了方差分析，结果表明：模型拟合程度高、实验误差较小。研究为以最大限度地保留葡萄酒中白藜芦醇为目标的红葡萄酒发酵提供了一定理论基础。但是对于发酵过程中各因素对葡萄酒白藜芦醇含量变化的影响，还需在后续实验中进行探索。

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Effect of fermentation conditions on the resveratrol of wine in simulation system

REN Jian，SHI Jun-ling*
（College of Food Science and Engineering，Northwest Aamp;F University，Yangling 712100，China）

Central composite design was used to study the effect of initial pH，sulfur dioxide，temperature and alcoholic strength on content of resveratrol in wine in simulation system.A quadratic regression model was obtained for the resveratrol content in wine corresponding to the four parameters.The response surface method was also used to analyze the data and finally establish the forecast model.

wine；maceration；resveratrol；effect；response surface

TS262.6

A

1002-0306（2012）01-0175-05

2010－12－08 *通讯联系人

任健（1985-），男，硕士，研究方向：食品生物技术。