微波加热双酶协同水解玉米蛋白粉制备玉米肽

李 丽，崔 波

（山东轻工业学院，山东济南250353）

微波加热双酶协同水解玉米蛋白粉制备玉米肽

李 丽，崔 波*

（山东轻工业学院，山东济南250353）

以玉米蛋白粉为原料，采用微波加热多酶协同水解法制备小分子肽。确定了最佳水解工艺。水解后的多肽经过Sephadex G-15分离得到两个组分，分别测定两个组分对超氧自由基的抑制能力，结果为分子量大于1355u的组分对超氧自由基的清除能力大于分子量小于204u的组分。

玉米蛋白粉，酶解，抗氧化

玉米黄粉是玉米淀粉加工中的副产物，玉米经湿磨法工艺制得粗淀粉乳，再经蛋白质分离得到麸质水，然后浓缩干燥即制得玉米黄粉，俗称黄粉子。玉米黄粉含有丰富的蛋白质，其中中性氨基酸和芳香族氨基酸含量较高，是植物蛋白中较有特色的组成[1]。但由于玉米蛋白溶解性差[2]，严重限制了其在食品中的应用。玉米肽的开发使玉米蛋白粉由不溶变为高度可溶[3]。此外，玉米肽具有的抗疲劳[4]、抗氧化[5-6]、促进乙醇代谢[7-8]、降血压[9-11]、保肝[12]等生理活性，使其极具开发前景，可以被广泛地应用于食品及相关领域。但是，目前玉米肽多采用单一酶水解方法制备，肽的产率较低[13]。本文采用双酶协同水解法制备玉米肽，产率得到较为明显的提高。刘振春等[14]利用微波和酶技术相结合，提取玉米蛋白粉中的黄色素。李磊等[15]研究表明，微波加热可以缩短蛋白酶解时间，提高分解效率，并且得出了微波加热和复合酶水解是将蛋白分解成多肽的高效方法。近年来超声在食品工业中的应用日益广泛。杨晓泉[16]等的研究表明低频超声主要影响大豆的7S蛋白组分，并使其发生聚合。梁汉华[17]研究表明超声处理大豆浆体及豆渣可有效提高蛋白质和固形物的萃取率。Wang[18]的研究表明超声处理蛋白质溶液可明显提高其亲水性和溶解性，其作用包括分解蛋白质分子、乳化蛋白质悬浮液以及使蛋白质发生聚合等，已有超声浸提玉米蛋白和大豆分离蛋白文献报道[19]。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

玉米黄粉（蛋白含量78%） 西王集团；中性蛋白酶Neutrase 0.8L（酶活：0.8AU/g），碱性蛋白酶Alcalase 3.0T（酶活：3.0AU/g），ɑ-淀粉酶（酶活：800FAU/g） 诺维信（中国）生物技术有限公司。

Sartorius PB-10精密酸度计 沈阳凯莱仪器销售有限公司；DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司；AL204电子天平 梅特勒-托利多仪器有限公司；落地式全温振荡器 上海精宏实验设备有限公司；HHS-2型电热恒温水浴锅 上海衡平仪器仪表厂；单槽式超声波清洗机 青岛冠吉自动化清洗设备有限公司；格兰仕微波炉（P70D20TJ-D3） 凯尔微波系统有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 玉米肽制备的工艺流程 玉米黄粉→超声波10min→α-淀粉酶（调pH5.5，50℃反应1h，95℃灭酶15min）→无水亚硫酸钠5g→加中性蛋白酶→一段酶解（pH7.0，50℃反应5h，95℃灭酶15min）→加碱性蛋白酶→二段酶解（pH8.5，50℃反应5h，95℃灭酶15min）→酶解液→冷冻干燥→玉米肽粗品→SephadexG-15分离纯化

1.2.2 测定方法 蛋白含量的测定：凯氏定氮；水解度的计算：本实验采用简易法测定蛋白质水解度（DH%），公式如下[20]：

式中：B为NaOH的体积（mL）；Mb为NaOH的浓度（mol/L）；Mp为蛋白质的质量，本实验中为玉米黄粉的质量乘以0.784；htot为每克原料蛋白质中肽键的mmol数，本实验中为9.2；α=10（pH-pK）/[1+10（pH-pK）]。

1.2.3 玉米黄粉的预处理

1.2.3.1 破碎 将玉米黄粉充分破碎后，过80目筛。

1.2.3.2 超声波处理 在超声作用下，强烈的搅拌剪切效应使分子内的吸引作用受到破坏，分子由卷曲状态成为较为伸展的状态，增加分子表面的电荷，加强了分子与分子之间、分子与溶剂之间的静电作用，溶液的流动阻力减小；溶液的粘度减小。由于卷曲的分子较伸展的分子具有更好的弹性，超声处理使溶液表现出弹性下降，但超声处理对储能模量的弱化作用低于对损耗模量的弱化作用[21]。利用超声波对玉米蛋白进行预处理，可显著地对玉米蛋白进行破壁，有利于酶发挥水解作用，提高玉米蛋白的水解度，并且缩短水解时间。

1.2.3.3 脱淀粉 在一般的玉米胚乳中，蛋白体被淀粉颗粒紧紧地包裹着，在扫描电镜照片上玉米蛋白体和淀粉颗粒呈牙状交错。而且在牙状交错的外围，还有一层蛋白质介质紧紧地包裹住淀粉粒。由于玉米胚乳中蛋白质和淀粉存在的特殊形态，使其在湿法制粉工艺中不能完全分离，得到的副产品玉米蛋白粉（黄粉）中仍含有25%左右的淀粉[5]。因此对玉米蛋白粉进行脱淀粉处理除去其中大部分的淀粉和糖，使得到的玉米蛋白粉中蛋白质含量大增，更有利于酶水解反应的进行[5]。

卫星传输技术主要是将新闻采集现场所收集到的视频和音频等内容通过卫星采集系统的处理，发射到与信息同步的卫星上，再通过卫星传送到电视台，该种技术所需要的成本较高，并且操作较为复杂。光纤传播技术主要的信息传输介质为光导纤维，该种技术有着较强的抗干扰能力，并且在传输过程中信息容量较大，但是，这种技术需要铺设光纤，受到了地理环境的影响。但是，4k技术的应用就有效解决了这些问题，其较高的灵活性以及高效性受到了电视台的青睐。

1.2.3.4 玉米黄粉蛋白的增溶 加入还原剂Na2SO3，玉米黄粉蛋白的溶解度增加，并且随着Na2SO3浓度增加，溶解度和NSI（氮溶指数）均增加。其主要原因在于，玉米蛋白中存在大量的二硫键，这些二硫键在蛋白质分子内和蛋白质分子间形成连结，使蛋白质分子结构紧凑，加入还原剂能在一定程度上破坏二硫键，使蛋白质分子结构变得松散，暴露出更多的肽键和亲水基团，增大了蛋白质的溶解性[5]。

1.2.4 分子量分布的测定

1.2.4.1 标准物质的选择和洗脱体积的确定 低聚肽的分子量主要分布在300～700u范围内，为了准确测定低聚肽的分子量分布，选用VB12（MW 1355u）和L-色氨酸（MW 204u）作为标准样品。根据测定的洗脱体积确定玉米肽的分子量分布情况。为了准确地确定洗脱体积，实验中先洗脱VB12和L-色氨酸，找出二者的洗脱体积，并且间隔10mL收集一次洗脱的馏分，而后在波长为361nm的紫外线分光光度计下测定每个馏分的吸光度，经测定可以得知VB12在90～100mL时具有最大吸收峰，而L-色氨酸在169mL处有最大吸收峰。结合两个标准样经过洗脱后出峰的情况，实验中将94mL之前被洗脱下来的确定为分子量大于1355u的大分子量肽，169mL之后被洗脱下来的确定为游离氨基酸（即MW＜204u），中间被洗脱下来的是分子量为204～1355u之间的低聚肽。

1.2.4.2 Sephadex G-15凝胶预处理及装柱 称取Sephadex G-15干粉38g，加入过量的蒸馏水，室温浸泡24h。而后加入适量pH7.2磷酸-磷酸盐缓冲溶液，沸水浴中加热1h。将溶胀好的凝胶冷却并脱气30min，此时便可以装柱。

1.2.4.3 上柱与洗脱 用3～5倍体积的磷酸-磷酸盐缓冲液平衡层析柱，凝胶柱平衡后即可进行上柱。上柱要在洗脱液液面恰好与凝胶床表面相平时加入样品液。实验中使用的核酸蛋白质检测仪的波长是280nm。

1.2.4.4 不同分子量大小的大豆肽含量的计算 将分子量分布曲线上从洗脱开始到洗脱体积为94mL时的峰面积记为S1，从洗脱体积为94mL到169mL时的峰面积记为S2，从洗脱体积为169mL到柱子平衡洗脱结束时的峰面积记为S3。

1.2.5.1 实验操作 邻苯三酚自氧化速率的测定取4.5mL 50mmol/L Tris-HCl缓冲溶液（pH8.2）、4.2mL蒸馏水在25mL的试管中混匀后在37℃水浴中保温20min，取出后立即加入在37℃预热过的3mmol/L邻苯三酚0.5mL，迅速摇匀后倒入比色皿，325nm下每隔30s测定吸光度，计算线性范围内每分钟内吸光度的增加，以10mmol/L HCl溶液配制空白管作为对照，记录结果。

按照上述步骤在加入邻苯三酚前先分别加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL的各样品液，蒸馏水相应减少。同样以10mmol/L HCl溶液配制空白管作为对照。测定吸光度，每个样品均重复3次，取其平均值。

1.2.5.2 抑制率计算方式

式中：△A1/△t为邻苯三酚自氧化时反应速率；△A2/△t为加入样品液后邻苯三酚自氧化时反应速率。

2 结果与分析

2.1 最佳工艺的确定

取四组样品，分别对其进行以下处理：1号微波处理10min、单一酶水解；2号微波处理10min、复合酶水解；3号无微波处理、单一酶水解；4号无微波处理、复合酶水解。水解度测定结果分别为：37.21%、40.02%、36.45%、29.35%。

对水解后的酶解液进行凯氏定氮，结果如下：1号11.58mg N/mL、2号33.03mg N/mL、3号15.98mg N/mL、4号20.12mg N/mL。

综合上述数据可得，微波处理加热、双酶协同水解的效果最佳。

2.2 分子量的测定

本实验选用VB12和L-色氨酸作为标准样品。VB12、L-色氨酸的凝胶过滤层析图谱如图1、图2所示。

图1 L-色氨酸凝胶过滤层析图谱Fig.1 Gel Filtration Chromatography Map of L-tryptophan

图2 VB12凝胶过滤层析图谱Fig.2 Gel Filtration Chromatography Map of VB12

由图1可知，L-色氨酸凝胶过滤层析图谱中只出现一个峰值，表明L-色氨酸样品（MW 204u）的纯度达到要求，经测定L-色氨酸在169mL处有最大吸收峰。由于色氨酸是分子量最大的氨基酸，而本实验所研究的大豆肽分子量均大于204u。因此将L-色氨酸作为标准物质的下限是可行的。

由图2可知，VB12凝胶过滤层析图谱中出现两个峰值，说明VB12样品（MW 1355u）的纯度未达到要求。为确定VB12的最终洗脱体积，还需要进一步检测其吸光度。VB12在紫外吸收光谱上有三个吸收峰，分别为278、361、550nm，并且在361nm处的吸收峰干扰因素最少，吸收能力最强。因此选择在波长为361nm的紫外线分光光度计下检测其吸光度。经测定可以得知VB12在90～100mL时具有最大吸收峰。本课题所研究的大豆肽分子量分布范围约为300～1000u，因此将VB12作为标准物质的上限是可行的。

图3 水解6h酶解液的凝胶过滤层析图谱Fig.3 Gel filtration chromatography Map of hydrolysis for 6h

表1 水解玉米胚芽生产玉米肽的分子量分布（%）Table 1 Molecular weight distribution of corn peptide in hydrolysis of corn germ（%）

2.3 邻苯三酚自氧化速率

每隔30s所测邻苯三酚自氧化速率吸光值结果见表2。由表2可知，邻苯三酚自氧化速率ΔA1/Δt=0.037。

表2 邻苯三酚自氧化速率Table 2 Autoxidation rate of Pyrogallol

2.4 不同浓度玉米胚芽肽抗氧化速率

MW＞1355u命名为组分1，MW＜204u命名为组分2。

表3 不同组分的抑制率（%）Table 3 The Inhibitory rate of different Components（%）

图4 组分1对超氧自由基的抑制率曲线Fig.4 The curve of the Inhibitory rate for the component 1

由图4和图5可知，组分1的IC50为1.06mg，组分2的IC50为2.20mg。组分1对超氧自由基的清除能力大于组分2。

3 结论

微波作为一种强化反应的技术，可以加速分子间的运动，提高分子的平均能量，大幅度提高反应的速率和产率。

利用超声波对玉米蛋白进行预处理，可显著地对玉米蛋白进行破壁，有利于酶发挥水解作用，提高玉米蛋白的水解度，并且缩短水解时间。

双酶协同作用增加了蛋白质催化位点，与传统的单一酶水解相比能更有效地将玉米蛋白分解成相对分子质量低的小分子玉米肽。

由实验结果可得出如下结论：微波处理加热、双酶协同水解可以提高酶解得率。水解后得到的多肽主要分子量分布在＞1355u和＜204u。MW＞1355u的组分对超氧自由基的清除能力大于MW＜204u。

图5 组分2对超氧自由基的抑制率曲线Fig.5 The curve of the Inhibitory rate for the component 2

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Microwave heating to hydrolyze corn protein into low molecular weight peptides by enzyme’s cooperation

LI Li，CUI Bo*
（Shandong Institute of Light Industry，Jinan 250353，China）

Microwave was used to hydrolysis corn protein into low molecular weight peptides by enzymes cooperation.Using hydrolysis degree as standards the optimized conditions of one enzyme hydrolysis，the best condition of low molecular weight of corn polypeptides was determined.The peptides were separated by Sephadex G-15.Determine the inhibitiory ability of two components of super oxygen free radical.The result showed that the fraction with molecular weight more than 1355u displayed higher antioxidant activity.

corn protein；enzymatic hydrolysis；antioxidant

TS210.1

B

1002-0306（2012）01-0285-04

2010－11－05 *通讯联系人

李丽（1985-），女，硕士研究生，研究方向：功能性食品与食品添加剂。