戊地昔布联合阿霉素对人乳腺癌细胞增殖的抑制作用及其机制研究Δ

刘焕龙，康宁，李军霞，陈雪彦，张志清#

（1.河北医科大学第二医院药学部，石家庄0 5 0 0 0 0；2.河北医科大学药理教研室，石家庄 0 5 0 0 1 7）

戊地昔布联合阿霉素对人乳腺癌细胞增殖的抑制作用及其机制研究Δ

刘焕龙1＊，康宁1，李军霞2，陈雪彦2，张志清1#

（1.河北医科大学第二医院药学部，石家庄0 5 0 0 0 0；2.河北医科大学药理教研室，石家庄 0 5 0 0 1 7）

目的：研究戊地昔布联合阿霉素对人乳腺癌细胞（MCF-7）增殖的抑制作用及其机制。方法：将人MCF-7细胞随机分为空白对照组、溶剂对照组、阿霉素（0.2 5 mg·L－1）组、戊地昔布（2 5、5 0、1 0 0 μmol·L－1）组及联用组（阿霉素0.2 5 mg·L－1+戊地昔布2 5、5 0、1 0 0 μmol·L－1），加入相应药物继续培养，检测培养2 4、4 8、7 2 h（n＝6）后各组人MCF-7细胞的增殖抑制率；检测戊地昔布2 5 μmol·L－1时培养4 8 h后各组细胞周期和增殖细胞核抗原（PCNA）蛋白、细胞周期蛋白（Cyclin D1）及环氧酶2（COX-2）蛋白表达。结果：与溶剂对照组比较，除戊地昔布2 5 μmol·L－1培养2 4 h外，阿霉素组、戊地昔布组及联用组增殖抑制率均明显增加（P均＜0.0 1），且呈浓度、时间依赖性；与阿霉素组和戊地昔布组比较，联用组增殖抑制率均明显增加（P均＜0.0 1）。戊地昔布组细胞阻滞于G0/G1期，S期细胞比例明显减少（P＜0.0 5）；联用组细胞阻滞于G0/G1期和G2/M期。与溶剂对照组比较，戊地昔布组、阿霉素组及联用组PCNA、Cyclin D1蛋白表达均明显降低（P＜0.0 5或P＜0.0 1），仅戊地昔布组和联用组COX-2蛋白表达明显降低（P＜0.0 5或P＜0.0 1）。结论：戊地昔布与阿霉素联用具有协同抑制人MCF-7细胞增殖的作用，可能与抑制Cyclin D1和PCNA蛋白表达从而阻滞细胞周期有关。

人乳腺癌细胞；戊地昔布；阿霉素；细胞增殖；细胞周期

乳腺癌是妇女常见的恶性肿瘤，其治疗方法目前仍以化疗为主。经典的化疗药物包括蒽环类抗菌药物，如阿霉素等，但阿霉素等化疗药物抗肿瘤的同时可诱导肿瘤组织环氧酶2（COX-2）表达，促进肿瘤生长。因此，COX-2抑制剂有望增强阿霉素等药物的抗肿瘤作用、减轻毒性，此联合用药方案可能突破乳腺癌等肿瘤治疗的瓶颈。COX-2在肿瘤形成过程中有重要的作用，不仅促进肿瘤细胞增殖，抑制肿瘤细胞凋亡，也促进肿瘤的侵袭和转移[1]。戊地昔布是第2代选择性COX-2抑制剂，对COX-2的选择性高，所致胃肠道等不良反应发生率低。前期研究[2，3]发现，戊地昔布对人胃癌BGC 2 8 2 3细胞生长及Lewis肿瘤有明显的抑制作用，但其能否抑制乳腺癌细胞增殖、与阿霉素联用是否有协同作用尚未见报道。因此，本实验通过观察戊地昔布联合阿霉素对人乳腺癌细胞（MCF-7）的增殖抑制作用，并探讨其可能的机制，为乳腺癌的临床治疗提供理论依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

凝胶成像仪（美国Thermo Forma公司）；Epics-XLⅡ型流式细胞仪（美国Beckman Coulte公司）。

1.2 试药

戊地昔布原料药（河北医科大学药学院制备，纯度：9 9%）；注射用阿霉素灭菌粉末（浙江海正药业有限公司，批号：1 0 1 0 0 2，规格：每支1 0 mg）；MTT（德国Serva公司）；抗增殖细胞核抗原（PCNA）抗体、细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）抗体、COX-2抗体及β-肌动蛋白（β-actin）抗体均购自美国Santa Crutz公司；辣根过氧化酶（HRP）标记的二抗（美国KPL公司）。

1.3 细胞

人MCF-7细胞株，由河北医科大学第四医院科研中心提供。

2 方法

2.1 细胞培养

将人MCF-7细胞置于含1 0%胎牛血清的RPMI 1 6 4 0培养液中，于3 7℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中常规培养。0.2 5%的胰蛋白酶消化，每2～3 d传代1次。取对数生长期细胞，制备合适密度的细胞悬液，接种于9 6孔板或培养瓶中，待细胞贴壁后，按分组加入相应药物后继续培养。

2.2 MTT法检测细胞增殖抑制率

取对数生长期细胞以5×1 04个/孔接种于9 6孔板上，每孔0.2 mL。待细胞贴壁6 h后，轻轻吸去上清液，按空白对照组、溶剂对照组、阿霉素（0.2 5mg·L－1）组、戊地昔布（2 5、5 0、1 0 0 μmol·L－1）组及联用（阿霉素0.2 5mg·L－1+戊地昔布2 5、5 0、1 0 0 μmol·L－1）组，加入相应药物，继续培养，除空白对照组外其余各组为试验组。于培养后2 4、4 8、7 2 h（n＝6）每孔分别加入MTT溶液（5 g·L－1）2 0 μL，置培养箱中继续培养4 h，然后吸弃上清液，加入二甲基亚砜2 0 0μL溶解紫色结晶，室温震荡1 0 min，置自动酶标仪上于5 7 0 nm波长下测定各孔吸光度OD值。并通过下列公式计算细胞增殖抑制率：增殖抑制率（%）＝（空白对照组OD值－试验组OD值）/空白对照组OD值×1 0 0%。

2.3 流式细胞仪检测细胞周期变化

取生长良好的细胞以合适密度接种于培养瓶中，待贴壁后随机分为溶剂对照组、阿霉素组（0.2 5 mg·L－1）、戊地昔布组（2 5 μmol·L－1）及联用组，加入相应药物，继续培养4 8 h，消化，离心，收集细胞于离心管，再用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤2次（每次1 0 0 0 r·min－1离心1 0 min），收集并调整细胞为1×1 06个/mL，用7 0%的冷乙醇固定，4℃贮存。染色前用PBS洗去固定液，加1 0 0 μL RNA酶（5 0 mg·L－1），3 7℃水浴3 0 min，再加入4 0 0 μL碘化丙啶（1 0 μg·L－1）染色混匀，4℃避光3 0 min，流式细胞仪检测。计算机处理并分析细胞增殖周期中G0/G1、S和G2/M期细胞数占总细胞数的百分比。

2.4 Western blot法检测PCNA、Cyclin D1及COX-2蛋白表达

细胞按“2.3”项下方法分组，各组细胞经药物处理4 8 h后，收集细胞，PBS洗2次，加入RIPA细胞裂解液，超声2 min，冰上放置1 h，使细胞充分裂解，采用二喹啉甲酸（BCA）法进行蛋白定量。等量蛋白（2 0 μg）上样，SDS-PAGE电泳，电转至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上（4℃、2 h），室温下用含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液封闭1 h，加入一抗（PCNA、Cyclin D1、COX-2抗体），4℃孵育过夜，次日TBST洗膜3次，每次1 0 min，然后加入相应HRP标记的二抗，3 7℃孵育1 h。TBST洗膜3次，底物显色。凝胶成像仪照相，以β-actin为对照，测定灰度值，试验重复3次。

2.5 统计学处理

所有数据均采用SPSS 1 5.0软件进行数据分析，数据以x±s表示，采用单因素方差分析，Dunnet t检验进行组间比较。P＜0.0 5表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 细胞增殖抑制率

空白对照组和溶剂对照组人MCF-7细胞体外生长良好，2组OD值无明显差异。与溶剂对照组比较，除戊地昔布2 5 μmol·L－1培养2 4 h外，阿霉素组、戊地昔布组及联用组增殖抑制率均明显增加（P均＜0.0 1），且呈浓度、时间依赖性；与阿霉素组和戊地昔布组比较，联用组增殖抑制率均明显增加（P均＜0.0 1）。各组人MCF-7细胞的增殖抑制率比较详见表1。

表1 各组人MCF-7细胞的增殖抑制率比较（n＝6）Tab 1 Comparison of inhibition rates of human MCF-7 cells proliferation in each group（n＝6）

3.2 细胞周期

戊地昔布组作用于人MCF-7细胞可使细胞阻滞于G0/G1期，而S期细胞比例显著降低（P＜0.0 5），但对G2/M期细胞比例无明显影响。阿霉素组作用于人MCF-7细胞可使细胞周期阻滞于G2/M期，S期细胞比例也显著降低（P＜0.0 1），但对G0/G1期细胞比例无明显影响。联用组G0/G1期和G2/M期细胞比例与溶剂对照组相比均明显增加（P＜0.0 1），S期细胞比例显著降低（P＜0.0 1）。各组人MCF-7细胞周期分布情况见表2。

3.3 PCNA、Cyclin D1和COX-2蛋白表达

PCNA、Cyclin D1和COX-2蛋白在溶剂对照组人MCF-7细胞中均高表达。与溶剂对照组比较，戊地昔布组、阿霉素组及联用组PCNA、Cyclin D1蛋白表达均明显降低（P＜0.0 5或P＜0.0 1），仅戊地昔布组和联用组COX-2蛋白表达明显降低（P＜0.0 5或P＜0.0 1）。各组人MCF-7细胞Cyclin D1、PCNA和COX-2蛋白表达情况见图1，柱状图见图2。

表2 各组人MCF-7细胞周期分布情况（x±s，n＝6）Tab 2 Distribution of cell cycle of human MCF-7 cells in each grou（px±s，n＝6）

图1 各组人MCF-7细胞PCNA、Cyclin D1和COX-2蛋白表达情况Fig 1 Protein expressions of PCNA，Cyclin D1 and COX-2 in human MCF-7cells of each group

图2 各组人MCF-7细胞PCNA、Cyclin D1和COX-2蛋白表达柱状图与溶剂对照组比较：＊P＜0.0 5，＊＊P＜0.0 1Fig 2 Histogram of protein expressions of PCNA，Cyclin D1and COX-2in human MCF-7cells of each group vs.solvent control group：＊P＜0.0 5，＊＊P＜0.0 1

4 讨论

研究表明，COX-2参与了许多恶性肿瘤包括乳腺癌的发生发展过程，涉及肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭和转移以及血管生成[4]。选择性COX-2抑制剂可抑制胃肠道、乳腺癌等肿瘤细胞增殖，诱导凋亡。本研究结果表明，戊地昔布可显著抑制人MCF-7细胞的增殖，且抑制率具有一定的浓度和时间依赖性。不同浓度的戊地昔布和阿霉素联用具有协同抑制人MCF-7细胞增殖的作用，表明戊地昔布可促进阿霉素的抗肿瘤作用。

肿瘤细胞增殖与细胞周期密切相关，包括G1-S-G2-M 4个时相，其中G1-S和G2-M 2个转变点是细胞周期启动的关键[5]。调节细胞周期是抗肿瘤治疗的新途径，为进一步探讨戊地昔布与阿霉素的协同作用机制，本研究采用流式细胞仪检测了细胞周期进展。结果表明，戊地昔布单药作用于人MCF-7细胞可使细胞周期阻滞于G0/G1期，而S期细胞比例显著减少；阿霉素是细胞周期非特异性药物，通过将肿瘤细胞阻滞于G2/M期而发挥其直接杀伤作用[6]，本研究结果也证明了这一点；联用组G0/G1期和G2/M期细胞比例与溶剂对照组相比均明显增加，S期细胞比例显著减少，说明两药联用对细胞周期有协同阻滞作用，提示戊地昔布和阿霉素联用对人MCF-7细胞的增殖抑制作用与抑制细胞周期进展有关。本研究还在基因和蛋白水平上探讨了两药对PCNA、Cyclin D1、COX-2蛋白表达的影响。PCNA是分子量为3 6 kD的核蛋白，在G1期和S早期诱导合成，对细胞周期调控有重要作用[7]。Cyclin D1作为细胞周期的启动因子，推动了细胞周期G1期的进程，如抑制Cyclin D1的活性，细胞便无法进入S期[8]。本研究结果表明，戊地昔布和阿霉素单独用药均明显降低人MCF-7细胞PCNA和Cyclin D1的蛋白表达，联用后抑制蛋白表达作用更为明显，显著降低了肿瘤细胞的增殖作用。同时也检测了戊地昔布对人MCF-7细胞COX-2蛋白表达的变化，结果表明戊地昔布能明显抑制COX-2蛋白表达，说明其抑制人MCF-7细胞增殖作用可能与抑制COX-2表达、降低前列腺素E2（PGE2）生成有关。

总之，戊地昔布与阿霉素联用具有协同抑制人MCF-7细胞增殖的作用，可能与抑制Cyclin D1和PCNA蛋白表达从而阻滞细胞周期有关。

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Inhibitory Effects of Valdecoxib Combined with Adriamycin on Proliferation of Human MCF-7 Cells and Its Mechanism

LIU Huan-long，KANG Ning，ZHANG Zhi-qing
（Dept.of Pharmacy，The Second Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 0 5 0 0 0 0，China）
LI Jun-xia，CHEN Xue-yan（Pharmacology Teaching and Research Section，Hebei Medical University，Shijiazhuang 0 5 0 0 1 7，China）

OBJECTIVE：To study the inhibition effects of valdecoxib combined with adriamycin on the proliferation of human MCF-7cells and its mechanism.METHODS：Human MCF-7cells were randomly divided into blank control group，solvent control group，adriamycin group（0.2 5mg·L－1），valdecoxib group（2 5，5 0，1 0 0μmol·L－1）and combination group（adriamycin 0.2 5mg·L－1+valdecoxib 2 5，5 0，1 0 0μmol·L－1）.The inhibition rates of human MCF-7cell proliferation were determined 2 4，4 8，7 2h after treated with relevant medicine（n＝6）.Cell cycle，the protein expressions of PCNA，Cyclin D1and COX-2in various groups were detected 4 8h after cultured in valdecoxib 2 5μmol·L－1.RESULTS：Compared with sdvent control group，the inhibition rate of cell proliferation was increased significantly in adriamycin group，valdecoxib group and combination group，except for culture of valdecoxib 2 5μmol·L－1for 2 4h（all P＜0.0 1），in concentration and time-dependant manner； compared with adriamycin group and valdecoxib group，the inhibition rate of cell proliferation was increased significantly in combination group（all P＜0.0 1）.Valdecoxib markedly blocked the MCF-7cell progression by arresting the cells in the G0/G1phase，and the percentage of cells in S phase decreased dramatically（P＜0.0 5）；and valdecoxib combined with adriamycin blocked the MCF-7cell progression by arresting the cells in G0/G1and G2/M phase（P＜0.0 5）.Compared with solvent control group，the protein expressions of PCNA and Cyclin D1in valdecoxib group，adriamycin group and combination group were decreased significantly（P＜0.0 5or P＜0.0 1），while the protein expression of COX-2in valdecoxib group and combination group decreased significantly（P＜0.0 5or P＜0.0 1）.CONCLUSION：Valdecoxib synchronized with adriamycin can inhibit the proliferation of human MCF-7cells significantly，which may be associated with the inhibition of Cyclin D1and PCNA expression and the blockage of cell cycle.

Human MCF-7cells；Valdecoxib；Adriamycin；Cell proliferation；Cell cycle

R9 6 5

A

1 0 0 1-0 4 0 8（2 0 1 2）2 9-2 7 0 5-0 3

DOI1 0.6 0 3 9/j.issn.1 0 0 1-0 4 0 8.2 0 1 2.2 9.0 6

Δ河北省2 0 0 9年医学科学研究重点课题计划项目（2 0 0 9 0 3 5 8）

＊副主任药师，硕士。研究方向：肿瘤药理学。E-mail：lhlong0 9 0 4@1 6 3.com

#通讯作者：主任药师，博士。研究方向：临床药学、药理学和新型药物制剂。E-mail：zhangzhq@medmail.com.cn

2 0 1 1-0 8-1 5

2 0 1 1-1 0-1 1）