钙黏蛋白和基质金属蛋白酶-2在非小细胞肺癌中的表达及其与血管生成拟态的关系

武世伍 承泽农 俞 岚 宋文庆 陶仪声 (蚌埠医学院第一附属医院病理科，安徽 蚌埠 233000)

钙黏蛋白和基质金属蛋白酶-2在非小细胞肺癌中的表达及其与血管生成拟态的关系

武世伍1承泽农1俞 岚1宋文庆1陶仪声1(蚌埠医学院第一附属医院病理科，安徽 蚌埠 233000)

目的 探讨在非小细胞肺癌(NSCLC)中E-钙黏蛋白(E-cad)和基质金属蛋白酶-2(MMP-2)的表达及其与血管生成拟态(VM)的关系。方法 采用免疫组化ElivisionTMplus法和特殊组织化学法检测160例NSCLC和20例正常肺组织中E-cad、MMP-2的表达水平和VM情况。结果 在正常肺组织中E-cad、MMP-2的表达率和VM分别为100%、25.0%和0%，在NSCLC组织中分别为45.6%、66.3%和36.9%，差异显著(P＜0.01);其水平与肿瘤细胞分化程度、淋巴结转移、临床分期和术后生存期有关(均P＜0.01);E-cad的表达水平与MMP-2的表达水平及VM呈负相关，MMP-2的表达水平与VM呈正相关(均P＜0.01)。Kaplan-Meier生存分析表明MMP-2的过表达和VM均与患者的生存率有关，阳性患者生存率明显低于阴性者(P＜0.01);而E-cad阳性表达的患者生存率明显高于阴性者(P＜0.01)。多因素分析：PTNM分期、淋巴结转移、E-cad和MMP-2的表达以及VM是影响NSCLC根治术后患者预后的独立因素(P＜0.01)。结论 E-cad、MMP-2在NSCLC组织中的表达水平以及VM与肿瘤的分化程度、转移和预后等均有关，E-cad、MMP-2和VM联合检测对NSCLC的进展及预后判断有重要意义。

非小细胞肺癌;E-cad;MMP-2;VM;预后

血管生成拟态(VM)的存在与疾病进展和预后不良相关〔1〕。钙连蛋白是一种跨膜糖蛋白家族，介导同种细胞间、细胞与基质之间的黏附反应，维持正常上皮细胞形态、细胞极性及组织结构完整性〔2〕，其中上皮钙黏蛋白(E-cad)是钙连蛋白中的重要成员，当其表达水平降低时，就会引起细胞间黏附功能丧失，从而导致肿瘤发生浸润、转移。当肿瘤细胞从原发肿瘤分离脱落后，必须穿透原发肿瘤及其间质的基底膜。正常基底膜是由Ⅳ型胶原等成分构成，基质金属蛋白酶-2(MMP-2)是降解Ⅳ型胶原最主要的酶之一，当其表达水平增高时，可促使肿瘤细胞的侵袭及转移灶的形成。本研究探讨E-cad、MMP-2的表达和VM与NSCLC侵袭、转移及预后的关系。

1 材料与方法

1.1 一般资料 收集我科2003年1月至2005年4月存档石蜡包埋NSCLC组织标本160例(术前未行放、化疗)和正常肺组织标本20例，所有病例均有完整的临床、病理及随访资料，入选病例随访至患者死亡或截止2010年4月，随访时间为3～84个月，其中男130例，女30例;年龄26～82〔平均(59.6±9.5)〕岁，≥60岁86例，＜60岁74例。从大体类型看，中央型120例，周围型40例;鳞癌116例(高分化17例，中分化71例，低分化28例)，腺癌44例(高分化4例，中分化32例，低分化8例)。肿瘤长径D≥3.0 cm 145例，D＜3.0 cm 15例;按淋巴结有无转移，有转移76例，无转移84例。根据UICC2002版PTNM病理分期标准进行分期，其中Ⅰ期患者31例，Ⅱ期患者43例，Ⅲ期患者34例，Ⅳ期患者52例。对照组正常肺组织20例取自肺癌肿块＞5.0 cm的肺组织，病理HE染色证实。

1.2 试剂 鼠抗人E-cad单克隆抗体(产品编号：MAB-0589，克隆号：4A2C7)、鼠抗人MMP-2单克隆抗体(产品编号：MAB-0244，克隆号：75-7F7)、鼠抗人CD34单克隆抗体(产品编号：MAB-0034，克隆号 QBEnd/10)、ElivisionTMplus试剂盒以及DAB显色试剂盒均购自福州迈新生物技术开发公司。PAS染色液为蚌埠医学院第一附属医院病理科配制。

1.3 方法

1.3.1 采用免疫组织化学ElivisionTMplus法 将石蜡标本以4 μm厚连续切片，烤干，于二甲苯溶液及不同浓度的乙醇中脱蜡至水洗。免疫组化染色操作步骤按试剂盒说明书进行。采用已知阳性片作对照，以PBS液代替一抗作空白对照。

1.3.2 CD34和PAS套染 CD34染色，DAB显色后，流水冲洗1 min终止显色反应，PAS染色按照《临床技术操作规范-病理学分册》说明进行。

1.4 结果判定 CD34和E-cad均以细胞膜和细胞质出现棕黄色颗粒为阳性;MMP-2蛋白以细胞质有棕黄色细颗粒为阳性。采取二次计分法：每例标本随机计数5个高倍视野(×400)，计数每个高倍视野中阳性细胞所占百分比并计分。首先将染色强度计分：0分为无色，1分为淡黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色。再将阳性细胞百分比计分，0分为阴性，1分为阳性细胞为＜10%，2分为11% ～50%，3分为51% ～75%，4分为＞75%。用染色强度得分和细胞数得分的乘积作为判断表达结果，若积分≤1为阴性，＞1为阳性。免疫组化结果由高年资病理医师读片评定。

1.5 统计学分析 采用SPSS17.0统计软件进行数据分析。生存分析用Kaplan-Meier法，组间比较用Log-rank检验，多因素分析采用 Cox回归多因素模型，在 NSCLC组织中，E-cad、MMP-2的表达和VM与正常肺组织、各临床及病理因素的相关性采用χ2和Spearman等级相关检验。

2 结果

2.1 NSCLC中存在VM HE染色光镜下可见由肿瘤细胞围成的管道样结构，无内皮细胞衬覆，管腔内不见坏死的肿瘤细胞及炎症细胞。经CD34与PAS双重染色，管腔呈现CD34阴性但PAS阳性的结构，即VM，见图1。除外，还能见到网络状的VM。160例NSCLC标本中，36.9%(59/160)可见由 CD34阴性的肿瘤细胞围成的管道样或网络状的结构，而PAS阳性，一层PAS阳性物质将肿瘤细胞和管腔分开。正常肺组织中未见有VM现象。

2.2 NSCLC中的VM与临床病理的关系 VM阳性与患者的性别、年龄、组织学类型等之间差异无统计学意义(P＞0.05)。随着NSCLC的分化越差，VM的阳性越强，差异有显著性(P＜0.01)，PTNM分期Ⅰ～Ⅱ期VM阳性率为4.1%(3/74)，Ⅲ～Ⅳ期VM阳性率为65.1%(56/86)，VM组的PTNM分期与无VM组的PTNM分期相比差异有统计学意义(P＜0.01)，且VM组的患者更易发生淋巴结转移(P＜0.01)，见表1。

2.3 NSCLC中E-cad的表达及其与临床病理的关系 E-cad主要定位于NSCLC癌细胞膜和胞质，呈棕黄色。正常肺组织中E-cad阳性颗粒主要位于细胞质和膜。在NSCLC中，E-cad的阳性率为45.6%(见图1)，较正常肺组织的表达率(20/20)明显减少(P＜0.01)。E-cad的表达与患者性别、年龄及组织学类型无相关性(P＞0.05)。随着NSCLC的分化越差，E-cad的表达越低(P＜0.01);E-cad的阳性表达与淋巴结转移有关(P＜0.01);Ⅰ～Ⅱ期肿瘤中E-cad的阳性率为77.0%(57/74)，Ⅲ～Ⅳ期肿瘤中E-cad的阳性率为18.6%(16/86)，两者差异显著(P＜0.01)。见表1。

表1 VM、E-cad和MMP-2阳性表达与NSCLC临床病理关系(n)

2.4 NSCLC中MMP-2的表达及其与临床病理的关系

MMP-2主要表达于NSCLC癌细胞质，棕黄色，在胞膜中也有表达。对照组中也定位于胞质和膜，在NSCLC中MMP-2蛋白阳性表达率为66.3%(见图1)，较对照组的表达率(5/20)显著升高(P＜0.01)，其表达水平与NSCLC的分化程度、淋巴结转移及临床分期有关，即随着MMP2表达越高，肿瘤的分化越差、临床分期越晚、更易发生淋巴结转移。见表1。

2.5 NSCLC中E-cad、MMP-2的表达和VM情况以及它们的关系 在VM阳性组的病例中，E-cad阳性率为5.1%(3/59);在E-cad阳性表达的病例中，VM的阴性率为95.9%(70/73)，差异有统计学意义。Spearman相关分析显示，E-cad在NSCLC中的表达与 VM呈负相关(r=-0.622，P＜0.01)。E-cad与MMP-2的表达呈负相关(r=-0.593，P＜0.01)。MMP-2的表达与VM 呈正相关(r=0.463，P＜0.01)。

2.6 多因素分析 将病理组织分化，年龄、PTNM分期、肿瘤直径、肿瘤位置、淋巴结转移、性别、VM、E-cad和MMP-2表达等因素引入Cox模型进行多因素分析，结果显示：E-cad与MMP-2的表达和 VM、PTNM分期以及淋巴结转移是影响NSCLC患者预后的独立因素。见表2。

2.7 生存分析 本组病例总的5年生存率为26.9%。VM阳性组与阴性组5年生存率分别为1.7%(1/59)和41.6%(42/101)，差异有统计学意义(P＜0.01);E-cad阳性组与阴性组5年生存率分别为52.1%(38/73)和5.7%(5/87)，差异有显著性(P＜0.01);MMP-2阳性组与阴性组5年生存率分别为6.6%(7/106)和66.7%(36/54)，差异有显著性(P＜0.01)。

图1 VM、E-cad和MMP-2在NSCLC中的阳性染色(ElivisionTM，×400)

表2 160例NSCLC患者多因素分析

3 讨论

在卵巢癌、乳腺癌、肾癌、原发性胆囊癌、肝癌以及双分化肿瘤〔3～7〕中等相继报道有VM的存在。VM结构直接由肿瘤细胞围成，肿瘤细胞与血流之间仅有一层PAS阳性的基底膜样物相隔，无血管内皮细胞屏障，因此在肿瘤细胞释放的蛋白水解酶以及血流的冲击作用下，肿瘤细胞更容易穿透基底膜样物而直接进入血液，从而促进肿瘤的侵袭和转移。因此，VM的存在与肿瘤的转移和预后不良密切相关〔1，3〕。并且，新近研究表明：能够形成VM结构的肿瘤细胞具有某些干细胞特性，具有多向分化的能力〔8〕。本研究证实NSCLC中有VM的存在，具有VM结构的区域很少出现坏死和炎细胞，同时发现VM的检出率与肿瘤细胞分化程度、肿瘤转移与否及临床分期等密切相关。

E-cad表达异常可导致细胞正常黏附功能丧失或肿瘤细胞脱离原发病灶向其他部位转移〔9〕。本研究结果显示，在NSCLC中，随着肿瘤的进展，即随着肿瘤的分化越差、临床分期越晚和发生淋巴结转移，E-cad的表达率显著降低。且E-cad的表达与VM呈负相关，E-cad表达的减少，不仅使细胞间附着变得松散，也使得细胞内骨架缺失相邻细胞黏附而形成的固定作用，从而获得自身变形并形成腔隙的能力〔10〕，促进VM的形成。

因此MMP-2在肿瘤细胞突破基底膜屏障而浸润转移中起重要作用。MMP-2主要由肿瘤细胞、成纤维细胞和炎细胞分泌。本研究发现MMP-2蛋白在肿瘤组织中的表达水平比在正常组织中明显升高，差异有显著性;并且随着肿瘤分化越差、临床分期越晚，其表达水平也显著升高;在伴有淋巴结转移的肿瘤中其表达水平也较没有淋巴结转移的肿瘤显著升高，与文献报道一致。且MMP-2的表达VM呈正相关，提示MMP-2可能在恶性肿瘤细胞血管生成拟态中起着重要作用〔11〕。

本结果提示VM和MMP-2阳性组的NSCLC患者的生存时间比较短，比其阴性组预后差，这与文献报道一致〔3，12〕。E-cad阳性表达组的生存时间显著高于阴性表达组，这与其他学者研究结果相同〔13〕。

本研究提示E-cad蛋白的表达与VM、MMP-2阳性率可能存在一定联系。随着肿瘤的快速进展，肿瘤细胞分泌MMP-2的能力增强，与ECM相互作用，使细胞外蛋白水解、重塑形成可以输送血液的微循环管道结构即VM;而此时E-cad表达降低导致肿瘤细胞彼此之间附着变得松散，黏附力降低，移动性增强，并且获得自身变形能力而促进VM形成;而能够形成VM结构的肿瘤细胞与管腔仅间隔一层PAS阳性物质，此时黏附力降低的肿瘤细胞在MMP-2降解基底膜样物以及血流的冲击双重作用下，很容易脱离原发灶而发生淋巴结转移甚至远处转移。

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8 EI Hallani S，Boisselier B，Peglion F，et al.A new alternative mechanism in glioblastoma vascularization：tubular vasculogenic mimicry〔J〕.Brain，2010;133(Pt4)：973-82.

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13 Falkenback D，Nilbert M，Oberg S，et al.Prognostic value of cell adhesion in esophageal adenocarcinomas〔J〕.Dis Esophagus，2008;21(2)：97-102.

Expressions of E-cad and MMP-2in non-small cell lung cancer and their relationship to vasculogenic mimicry

WU Shi-Wu，CHENG Ze-Nong，YU Lan，et al.
Department of Pathology，Bengbu Medical College，the First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College，Bengbu 233000，Anhui，China

Objective To explore whether vasculogenic mimicry(VM)exists in non-small cell lung cancer(NSCLC)or not and elucidate its relationship to the expressions of E-cad or MMP-2.Methods Expressions of E-cad，MMP-2 and VM were examined by immunohistochemistry and histochemistry containing from 160 cases of NSCLC and 20 cases of normal lung tissue.Results The positive rates of E-cad and MMP-2，and VM in normal lung tissue were 100%，25.0%and 0%respectively and in NSCLC were 45.6%，66.3%and 36.9%.There were significant differences between normal lung and NSCLC tissues(P ＜0.01).The expressions of E-cad，MMP-2 and VM were significantly related with tumor differentiation，lymph node metastasis，clinical stage，postoperative survival time(all P ＜0.01).There was a negative correlation between expressions of E-cad and MMP-2.There was a negative correlation between expressions of E-cad and VM.And there was a positive relationship between VM and the expression of MMP-2.VM and overexpression of MMP2 were related poor prognosis：the survival rates were significantly lower in positive patients than those of negative patients(both P＜0.01);while the survival rate of the E-cad-positive was higher than that of E-cad-negative patients(P ＜0.01).PTNM stage，lymph node metastasis，positive expressions of E-cad and MMP-2 and VM were independent prognostic factors of NSCLC(P＜0.01).Conclusions VM and the expressions of E-cad and MMP-2 are related to differentiation，lymph node metastasis，clinical stage and prognosis of NSCLC.The combined detection of E-cad，MMP-2 and VM has an important role in predicting the progression and prognosis of NSCLC.

NSCLC;E-cad;MMP-2;VM;prognosis

R734.2

A

1005-9202(2012)17-3623-04;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.17.003

安徽省高等学校优秀青年人才基金项目(No.2012SQRL095)

1 蚌埠医学院病理学教研室

陶仪声(1965-)，女，教授，主要从事肿瘤病理研究。

武世伍(1977-)，男，硕士，讲师，主要从事肺癌病理研究。

〔2011-06-16收稿 2011-09-16修回〕

(编辑 聂素滨)