老年脑梗死患者热休克蛋白70-1基因的多态性

魏云鸿 金醒昉 何 燕 杨文慧 (昆明市延安医院 云南省老年病研究中心，云南 昆明 650051)

老年脑梗死患者热休克蛋白70-1基因的多态性

魏云鸿 金醒昉 何 燕 杨文慧 (昆明市延安医院 云南省老年病研究中心，云南 昆明 650051)

目的 探讨热休克蛋白70(Hsp70)-1基因多态性与老年脑梗死之间的关系。方法 采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法检测101例老年脑梗死患者(其中包括脑梗死并高血压患者67例和脑梗死不合并高血压患者34例)、115例老年高血压患者和100例老年健康者Hsp70-1+190位点基因多态性。结果 老年脑梗死组Hsp70-1+190位点GC基因型所占比例(59.41%)高于老年健康组(36%)(P=0.001)。老年脑梗死不合并高血压组Hsp70-1 GC基因型所占比例(82.35%)分别高于老年脑梗死并高血压组(47.76%)、老年高血压组(45.22%)、老年健康组(36%)，OR 值分别为5.104(95%CI：1.871 ～13.925，P=0.001)、5.654(95%CI：2.175 ～14.695，P ＜0.001)、8.296(95%CI：3.140～21.922)(P＜0.000 1)。结论 Hsp70-1基因多态性与老年脑梗死遗传易感性有关;检测Hsp70-1+190位点基因多态性将可能作为预测脑梗死发生的一项重要指标。

热休克蛋白70-1;脑梗死;高血压;基因多态性

许多证据表明遗传因素在脑梗死的发病中有显著作用，脑梗死是由多个基因和环境因素共同作用导致的一类极其复杂的疾病。遗传因素在脑梗死的病理生理方面起着十分重要的作用。而热休克蛋白(Hsp)70作为热休克蛋白中最突出和最具特征性的一类，它主要参与机体耐受的形成〔1〕。当细胞或机体应激时，Hsp70蛋白生成显著增加，避免机体再次应激时遭受更为严重的损伤。研究显示，Hsp70蛋白水平的动态变化与缺血性脑梗死及其病情的轻重密切相关〔2〕。Hsp70基因多态性是否与脑梗死相关，国内外鲜有报道。为此，本研究对老年脑梗死患者与Hsp70-1基因多态性关系进行了一定的探讨。

1 资料与方法

1.1 研究对象 (1)病例组选自2007年1月至2010年7月间云南省昆明市延安医院干疗/老年病科住院患者，包括老年脑梗死(均为动脉硬化性脑梗死，以后简称脑梗死)组101例(包括脑梗死并高血压组患者67例，脑梗死不合并高血压组患者34例)、老年高血压组115例，均为昆明地区汉族;所有病例高血压诊断符合1999年世界卫生组织与国际高血压学会制定的高血压诊断标准，脑梗死诊断符合《实用内科学》第12版制定的动脉粥样硬化性脑梗死的诊断标准，所有研究对象均排除瓣膜性心脏病、双下肢静脉血栓、房颤、血液病、颅内肿瘤、脑血管畸形或动脉瘤等引起的继发性脑卒中。(2)老年健康组来自研究期间就诊于云南省昆明市延安医院体检中心的昆明地区汉族人群，经各项体检健康，并排除高血压、脑梗死、神经、心理疾病、自身免疫性疾病、癌症及其他慢性疾病。三组研究对象年龄、性别、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)和尿酸(UA)之间无统计学差异(P＞0.05)。见表1。

1.2 研究方法

1.2.1 标本采集 受检者禁食12 h后，于清晨取用EDTA抗凝管取静脉血2 ml，并将血标本保存于-80℃冰箱中准备提取基因组DNA。

1.2.2 DNA的提取 基因组DNA的提取使用AXYGEN公司“AxyPrep血基因组DNA试剂盒”从全血中提取并保存于-80℃冰箱中。

1.2.3 目的片段聚合酶链反应(PCR) (1)用Primer 5.0设计引物序列，由上海生物工程有限公司(Sangon)合成，上游引物5'-AAAGGCGGGTCTCCGTGAC-3'，下游引物5'-TTGGCGATGATCTCCACCTT-3'，PCR目的片段长度为359 bp。(2)PCR反应：PCR 反应体系为25 μl，包括Fermentas公司PCR Master Mix(2 × )12.5 μl、上下游引物各 0.5μl、DNA 模板 3 μl，使用：美国BIO-RAD公司梯度PCR仪进行反应，PCR反应条件为95oC变性 5 min 后，按 95℃变性 30 s，56℃退火30 s，72℃延伸 30 s，反复循环35次，最后72℃延伸5 min。PCR扩增后，取2 μl PCR反应产物做琼脂糖凝胶电泳检验。

1.2.4 限制性内切酶法检测Hsp70-1基因型 将PCR扩增产物用限制性内切酶BrsB I(Fermentas公司)在37℃恒温箱中消化24 h，359 bp的PCR扩增产物DNA被BrsB I酶切后用2%琼脂糖凝胶电泳分析酶切片段，若出现116和243 bp两条条带，判定为GG纯合基因型;若出现116、243和359 bp三条条带，判定为GC杂合基因型;若出现359 bp一条条带，判定为CC纯合基因型。

1.2.5 基因测序 对Hsp70-1 PCR扩增后的目的条带进行基因测序，每种基因型不少于10%的检测量，未被酶切开的一条带纯合基因型全部送检(基因测序委托上海生工完成，所用测序仪器为ABI-PRISM3730，测序试剂为BigDyeterminator v3.1)。将测序结果与酶切结果比对后发现，符合率达100%。

1.3 统计学分析 应用SPSS 13.0统计软件对所有实验结果进行统计学分析。计量资料符合正态分布，以±s表示，两组之间计量资料比较用t检验，两组以上比较采用单向方差分析;计数资料以频数和百分比表示，计数资料比较用χ2检验。采用Logistic回归分析计算特定危险因素的比值比(OR)及其95%置信区间(CI)。

2 结果

2.1 各组基本资料比较 各组基本资料比较见表1。各组研究对象除空腹血糖(FPG)、高密度脂蛋白(HDL)比较具有统计学差异(P＜0.05)外，五组研究对象的性别、年龄、TC、TG、LDL和UA之间无统计学差异(P＞0.05)。

2.2 Hsp70-1 PCR反应产物 电泳后，紫外灯下显示359 bp电泳带，见图1。经BrsB I内切酶酶切后，若酶切结果出现116和243 bp两条条带，判定为GG纯合基因型;若出现116、243和359 bp三条条带，判定为GC杂合基因型;若出现359 bp一条条带，判定为CC纯合基因型。电泳结果见图2。基因测序验证结果见图3。

表1 各实验组的基本资料比较

图1 Hsp70-1 PCR扩增目的片段的琼脂糖凝胶电泳结果

图2 Hsp70-1 PCR酶切产物电泳图

2.3 基因型结果

2.3.1 Hsp70-1+190位点各基因型在脑梗死组和健康组中的分布 Hsp70-1基因型在脑梗死组和健康组中的分布频率差异有统计学意义(P=0.004)，进一步分析发现，与健康组相比，Hsp70-1 GC基因型在脑梗死组中明显升高，达59.41%，OR为2.602(95%CI：1.472 ～ 4.599)(P=0.001)，说明携带 Hsp70-1 GC基因型的个体发生脑梗死的风险明显增加。而C、G等位基因分布频率在脑梗死和健康组之间差异无统计学意义(P＞0.05)。见表2。

图3 Hsp70-1 PCR扩增目的条带测序图

2.3.2 Hsp70-1+190位点各基因型及等位基因在脑梗死并高血压组、脑梗死不合并高血压组、单纯高血压组和健康组中的分布 四组间基因型分布频率比较：脑梗死不合并高血压组与脑梗死并高血压组、单纯高血压组、健康组相比，具有显著差异(P＜0.005);其余两组之间比较差异无统计学意义。进一步分析发现，脑梗死不合并高血压组Hsp70-1 GC基因型所占比例明显升高，达82.35%，与健康组比较，OR值为8.296(95%CI为3.140～21.922)(P＜0.000 1)，提示携带Hsp70-1 GC基因型的个体在无高血压的情况下，发生脑梗死的风险比另两种基因型更大。脑梗死不合并高血压组Hsp70-1 GC基因型所占比例明显升高，与脑梗死并高血压组、单纯高血压组比较，OR值分别为5.104(95%CI为1.871 ～13.925，P=0.001)、5.654(95%CI为2.175～14.695，P＜0.001)。见表2。四组间基因频率分布比较：脑梗死不合并高血压组与健康组相比，C与T等位基因频率存在显著差异(P=0.002)，危险度估计值OR值为2.530，95%CI为1.429～4.480，提示脑梗死不合并高血压发病率与G、C等位基因频率有关，即有C等位基因的人群中脑梗死的发生率较G等位基因更大。脑梗死不合并高血压组与单纯高血压组相比，有显著差异(P=0.008)，危险度估计值OR值为2.209，95%CI为1.268～3.849。其余两组之间比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表2。

表2 Hsp70-1+190位点各基因型及等位基因在各组中的分布〔n(%)〕

3 讨论

动脉硬化性脑梗死是指由于脑部血液供应障碍，缺血、缺氧引起的局限性脑组织的缺血性坏死或脑软化，其发病原因复杂。Duggirala等〔3〕认为遗传因素在卒中的发生中所占比重大约为66% ～74.9%。热休克蛋白(Hsp)是一个多基因家族，本身就提示其在漫长的生物进化过程中同时存在着遗传和变异，主要功能是帮助细胞适应一些应激反应。目前研究发现，Hsp70在心脏〔4〕和大脑〔5〕具有细胞保护作用;在发生脑梗死的不同个体中，淋巴细胞Hsp70的表达水平不同，病情的严重程度及预后也不同〔2〕;也有研究显示，Hsp70基因多态性与脑梗死发生的重要危险因素高血压、动脉粥样硬化等有关〔6〕。

Hsp70-1基因定位于6p21.3区MHCⅢ 类分子内，其编码的蛋白质呈结构性低水平表达，可以被热、脑缺血等诱导。Hsp70-1 基因在-110(A/C)，120(T/C)，190(G/C)和 438(C/T)有多态性位点，研究较多的是190(G/C)位点。

目前有关Hsp70-1基因多态性与疾病关系研究较多的是自身免疫性疾病和炎性疾病〔7〕。Ridker等〔8〕研究发现体内持续的低水平的炎性反应是导致动脉粥样斑块和血栓形成的主要因素，而后两者是脑梗死的主要危险因素。有研究发现〔2〕，Hsp70能够减轻缺血、缺氧对神经细胞的损害。本研究结果提示G、C等位基因单独对 mRNA的转录影响不明显，只有Hsp70-1基因+190位点为GC杂合子时才降低了mRNA的转录，从而降低了Hsp70的蛋白水平，使机体对脑缺血、缺氧应激的耐受性下降，这可能使脑梗死发生率升高，其中的病理机制可能是：(1)Hsp70-1基因+190位点位于该基因5'侧翼区，核苷酸的替换影响了启动子的功能;(2)该位点核苷酸的改变可能影响到mRNA的转录，从而对诱导性Hsp70表达水平产生影响。本研究结果与Liu等〔9〕人研究深圳市汉族Hsp70-1基因+190 G/C多态性与缺血性脑卒中相关的结果相似;但与Zee等〔10〕研究结果不一致，其原因可能是ZEE研究的对象都是来自高加索人群(白种人)，可能存在基因与基因，基因与环境的交互作用。

高血压是脑梗死最重要的独立危险因素。但本研究结果提示Hsp70-1+190位点基因多态性可能是脑梗死除高血压之外的比较特异性的危险因素，针对无高血压病史的患者，携带Hsp70-1+190位点CG基因型的个体要比其他两种基因型患脑梗死的概率高。而针对脑梗死并高血压组，该位点基因多态性与脑梗死不合并高血压组有差异，与单纯高血压及健康组均无差异，说明Hsp70-1+190位点基因多态性对高血压患者发生脑梗死的几率无明显影响。

总之，通过本研究我们发现Hsp70基因多态性在脑梗死的发生发展中具有重要价值，其中Hsp70-1+190位点GC基因型在脑梗死患者特别是脑梗死不合并高血压患者中明显升高，因此，检测脑梗死患者Hsp70-1+190位点基因型，将可能作为预测脑梗死发生的一项重要指标，并为进一步探索脑梗死的发病机制提供了一条新途径。

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R587.1

A

1005-9202(2012)17-3628-04;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.17.005

云南省科技厅-昆明医学院应用基础研究联合专项基金资助课题(2007C0041R);2007年昆明市卫生局课题

金醒昉(1962-)，女，主任医师，硕士，硕士生导师，主要从事老年病学研究。

魏云鸿(1981-)，女，硕士，住院医师，主要从事老年病学研究。

〔2011-11-03收稿 2012-02-12修回〕

(编辑 曹梦园)