细胞周期相关转录因子E2F－1在结直肠癌中的表达及临床意义＊

徐君毅 以敏 黄世锋△

（1广西医科大学第四附属医院普外一病区 广西柳州 545005；2广西中医药大学第一附属医院病理科 广西南宁 530021）

1986年Rovesdi［1］等在研究腺病毒感染细胞的核抽提物与腺病毒的E2启动子相互作用时发现了E2F家族的存在。E2F－1属细胞周期相关转录因子E2F家族成员之一，参与构成细胞核和转录因子复合物，与调控细胞周期和肿瘤的发生发展有着紧密的联系。为研究E2F－1在结直肠癌中的表达及临床意义，本研究采用免疫组化和蛋白印迹技术对35例原发性结直肠癌标本的E2F－1表达情况进行检测，探讨E2F－1蛋白表达与临床病理指标的关系。

1 材料与方法

1.1 标本来源 收集广西医科大学第四附属医院普外一病区2008年6月至2009年2月间经病理确诊的35例原发性结直肠癌手术切除标本。术中标本离体后，分别收取癌灶组织和距离癌灶边缘5cm以上无癌浸润的全层肠壁组织各两块，分别作为肿瘤组和癌旁对照组。所有癌旁对照组标本HE染色镜下无癌浸润。液氮中速冻10min后置于－70℃冰箱保存。

1.2 主要试剂 鼠抗人E2F－1单克隆抗体由美国Santa Cruz公司提供，辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗鼠抗体、SP染色试剂盒、DAB显色试剂盒均由北京中杉生物技术公司提供。

1.3 免疫组化 标本经10%中性福尔马林固定，常规脱水，石蜡包埋，切片厚度4μm。肿瘤组和癌旁对照组均经HE染色后阅片证实。标本常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，柠檬酸缓冲液pH6.1高温高压抗原修复2min后，10%过氧化氢和小牛血清分别作用30min。滴加稀释的一抗（稀释浓度为1∶200），湿盒内4℃孵育过夜，二抗和SP复合物孵育30min，每步骤间10%PBS洗片各3次，每次5 min。DAB显色。苏木素对比染色，梯度乙醇脱水，透明封片。PBS缓冲液代替一抗为阴性对照。

1.4 蛋白印迹 提取所有组织标本核蛋白。按照BCA法进行总蛋白定量，取50μg蛋白质样品加入含二巯基丙醇的上样缓冲液，煮沸变性5min后上样，以十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶（SDSPAGE）进行电泳分离，电泳完毕后电转至硝酸纤维素膜，5%脱脂奶粉室温封闭2h，1∶200鼠抗人单克隆抗体室温孵育2h，TBST摇床洗膜3次，每次10min。加入1∶1000HRP标记的山羊抗鼠抗体室温孵育1h，DAB试剂显色，内参照蛋白为β－actin。

1.5 结果分析 （1）免疫组化：E2F－1表达定位于细胞核，阳性表现为棕黄色颗粒。随机选取5个高倍视野，计数1000个细胞，根据阳性细胞所占比例分为4级：阳性细胞数0%～5%为阴性（－），阳性细胞数5%～25%为弱阳性（＋），阳性细胞数25%～75%为阳性（＋＋），阳性细胞数＞75%为强阳性（＋＋＋）；阳性表达率以（＋＋）和（＋＋＋）之和占总例数的百分比表示。（2）蛋白印迹：结果经凝胶图像处理系统分析处理，测出目的蛋白和内参照β－actin各条带光密度值，以目的蛋白与β－actin比值代表目的蛋白表达水平。

1.6 统计方法 用SPSS 17.0统计软件进行数据统计分析，计量资料行采用t检验；计数资料采用χ2检验；蛋白印迹结果行配对t检验，比较结直肠癌肿瘤组织和癌旁正常组织中E2F－1蛋白表达的差异，P＜0.05代表差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 肿瘤组与癌旁对照组 E2F－1的阳性表达情况 肿瘤组与癌旁对照组E2F－1的阳性表达率分别为60.0.%（21／35）、5.7%（2／35）。肿瘤组 E2F－1阳性表达率明显较癌旁对照组高，差异有统计学意义（P ＜0.05）。

2.2 E2F－1表达与结直肠癌临床病理特征的关系见表1。如表1显示，E2F－1的表达情况与患者年龄、性别、分化程度及部位等因素无明显相关性，与淋巴结转移及TNM分期均显著相关（P＜0.05）。

表1 E2F－1表达与结直肠癌临床病理特征的关系

2.3 蛋白印迹结果 用凝胶成像系统及分析软件进行图像扫描和分析，分别测得E2F－1和内参照β－actin各条带光密度值，以目的蛋白与β－actin比值代表其表达水平。肿瘤组与癌旁对照组平均表达水平分别为1.043±0.212和0.590±0.177。采用配对t检验比较肿瘤组和癌旁对照组中E2F－1蛋白表达量的差异，差异具有统计学意义（P＜0.05）（图1）。

图1 E2F－1在肿瘤组织的癌旁正常组织中的表达情况N1、N2为肿瘤组，T1、T2为癌旁对照组

3 讨 论

E2F－1是E2F转录因子家族成员之一，参与对细胞周期进展、细胞增殖和细胞凋亡的调控。近年多项研究证实，E2F－1在多种肿瘤组织或肿瘤细胞系中表达水平异常。杨志鸿等［2］研究发现E2F－1在肺癌组织中的阳性率显著高于正常肺组织。刘向真等［3］研究证实乳腺癌组织中E2F－1的表达率达60.71%，明显高于正常乳腺组织，提示E2F－1与乳腺癌存在相关。伍宏彪等［4］的研究结果也提示E2F－1在早期胃癌中高表达，晚期胃癌的进展可能与E2F－1表达降低有关。我们通过试验发现，结直肠肿瘤组织中E2F－1的阳性表达率为60.0.%（21／35），明显高于癌旁对照组，而且E2F－1的表达异常不仅仅是阳性细胞数目的变化，其蛋白表达量亦显著增加。与结直肠癌临床病理特征的单因素分析结果表明，E2F－1与淋巴结转移及TNM分期具有相关性。这一结果与杨建华等［5］的实验结果基本相近，提示E2F－1的表达水平上调与结直肠癌的进展和预后相关。

尹永硕等［6］利用RNA干扰技术下调胃癌细胞中E2F－1的表达水平，导致胃癌细胞的增殖和侵袭能力明显降低。E2F－1的功能是通过直接或间接对众多下游靶基因的调控而实现的，因此，我们可以认为E2F－1表达水平的变化最终将表现为其靶基因的表达水平变化，而肿瘤细胞生物学特性的变化则是这些靶基因表达变化的综合体现。深入研究E2F－1与靶基因的联系，将有利于理解其生物学功能。

［1］ Kovesdi I，Reichel R，Nevins JR.Identification of a cellular transcription factor involved in E1Atrans－activation［J］.Cell.1986，25；45（2）：219－228.

［2］ 杨志鸿，阮永华，金克炜等.E2F－1基因在肺癌中的表达及意义［J］.现代生物医学进展，2011，11（24）：4828－4830.

［3］ 刘向真，王如美.乳腺癌组织中E2F－1和Skp2的表达及意义［J］.现代肿瘤医学，2012，20（11）：2286－2288.

［4］ 伍宏彪，张鹏，李小强，等.胃癌组织中c－met、e2f－1和Ki－67的表达［J］.上海交通大学学报（医学版），2009，29（12）：1482－1486.

［5］ 杨建华，孙冬霞，王蕾等.大肠癌中核转录因子E2F－1及细胞周期因子D1的表达及意义［J］.现代预防医学，2012，39（19）：5068－5070.

［6］ 尹永硕，肖强，谢玉波，等.转录因子E2F－1siRNA对胃癌MGC803细胞体外侵袭及增殖能力的影响［J］.癌症，2008，（9）.2120－2124.