雌性乳鼠颅骨来源的成骨细胞培养方法的建立及其评价

那 键，马 超，霍维玲，秦瑞云，许 永，王 涛，吴晓东，谷贵山

（1.江苏省徐州市中心医院骨关节科，江苏 徐州 221009；2.吉林大学第一医院骨关节科，吉林 长春 130021）

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级雌性Wistar大鼠乳鼠40只

（出生48h以内），吉林大学动物实验中心提供。

1.2 主要试剂与仪器 茜素红（北京中山生物技术公司），台式高速离心机（湖南湘仪离心机仪器有限公司），倒置相差显微镜（NIKON公司），ELISA酶标仪（美国ELx800），β－甘油磷酸钠、地塞米松和维生素C（美国Sigma公司），碱性磷酸酶免疫组织化学试剂盒（南京建成生物制品有限公司），Ⅱ型胶原酶和胎牛血清（北京鼎国生物技术公司），高糖DMEM培养基（美国Gibco公司）

1.3 颅骨来源成骨细胞分离 将大鼠乳鼠拉颈处死，75%乙醇中浸泡10min，在超净工作台中无菌条件下平皿内取出颅骨，仔细剔除表面附着软组织，剔除骨缝之间软骨，用PBS浸泡冲洗3次，至骨块发白透亮，用眼科剪刀将其剪成1mm×1mm×1mm左右碎块。再加入10倍体积的0.25%胰蛋白酶，37℃水浴箱内置20min，每10min摇晃1次以消化掉纤维组织、成纤维细胞和血细胞，共2次，去除悬液，因为悬液里含有大量消化下来的成纤维细胞。然后再加入2倍体积的Ⅱ型胶原酶消化。在37℃水浴箱中1h，过200目筛网去除碎骨块，细胞悬液以1 000r·min－1离心5min，收集消化液中的细胞，PBS漂洗后接种于25cm2培养瓶，加入10%胎牛血清DMEM培养液，放置于37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中培养。胶原酶消化及提取细胞步骤重复4次。2～3d换液待细胞近铺满全瓶后传代。

1.4 细胞的传代培养 ①细胞融合后弃培养液，用PBS清洗3次；②用0.25%胰蛋白酶（含0.01%EDTA）1mL消化细胞，置细胞培养箱中消化2min，显微镜下观察，当细胞变圆、细胞间隙增大时，轻轻振动培养板使细胞脱壁，加入10%胎牛血清终止消化；……