蒙药金莲花片微生物限度检查方法验证

刘续芳 张秀兰 李占海

(内蒙古自治区人民医院，内蒙古 呼和浩特 010017)

金莲花片蒙名为阿拉腾花片，为金莲花单方制剂，是蒙医常用药，其主要有效成分为黄酮类化合物［1］，具有抗菌和抗病毒作用［2］，因含有抗菌成分，就可能影响微生物限度检查的准确性。所以在做微生物限度检查时，必须进行方法验证，以确认测定方法的可靠性。通过对金莲花片的微生物限度检查按2010版药典［3］的规定进行了方法验证，确立了该品种微生物限度检查方法。

1 材料

1.1 仪器:HTY—2000集菌仪、YJ—43—4000电动离心沉淀机、反复使用集菌培养器。

1.2 试剂:稀释剂:pH0.7氯化钠—蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠，营养琼脂培养基、玫瑰红纳琼脂培养基、胆盐乳糖培养基等由中国生物制品检定所提供。

1.3 试验菌珠:大肠埃希菌CMCC(B)44102，金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003，枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501，黑曲霉菌CMCC(F)98003，白色念珠菌CMCC(F)98001。以上5种菌由中国药品生物制品检定所提供。

1.4 供试品:金莲花片(承德天原药业有限公司生产 批号:110646)。

2 方法

2.1 细菌、霉菌计数方法的验证

2.1.1 菌液制备:接种大肠埃希菌、金黄色萄葡球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物到营养肉汤培养基，36±1℃培养18～24h，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释成每1mL含50～100CFU的菌悬液。做活菌记数备用。接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中。23～28℃培养18～24h，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释成每 1mL含 50～100CFU的菌悬液。做活菌记数备用。

接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养5～7d，使大量的孢子产生，加入3～5mL的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，吸出孢子菌液至灭菌试管内，将菌液稀释至每1mL含50～100CFU的菌悬液。做活菌记数备用。

2.1.2 供试液制备:取供试品10g，加稀释剂100mL制成1:10的供试液备用。

2.1.3 试验方法 常规法:采用加1mL·皿－1的供试液，加入15～20ml琼脂培养基做菌落记数。培养基稀释法:采用加0.2mL/皿－1的供试液，加入15～20mL琼脂培养基做菌落记数。离心薄膜过滤法:取1:10的供试液10mL移至灭菌的离心管中以500转/min离心10min后，取上清液1mL加入置有冲洗液的反复使用的薄膜滤器中，冲洗液300mL/膜，分3次冲洗。在最后的冲洗液中加入1mL菌液(50～100CFU·mL－1)滤干，然后取膜贴于琼脂板，置适宜的温度培养48～72d观察结果。

2.1.4 回收率测定 试验组:取1:10的供试液各1mL，加入50～100CFU的试验菌，立即注入45℃相应的琼脂培养基15～20mL，摇匀，凝固后，将平板倒置于规定的温度培养值规定的时间，计数其菌落数。菌液组:取试验菌液1ml，分别放人2个平皿，同上述方法计数所加的试验菌数。供试品对照组:取规定量的供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。

回收率计算:试验组的菌回收率(%)=(试验组平均菌落数－供试品对照组平均菌落数/菌液组平均菌落数)×100%

2.1.5 结果:常规法测定金莲花片试验数据及回收率见表1。

表1 金莲花片常规法

从表l的结果可以看出:金莲花片对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的回收率均低于70%，说明该药有抑细菌作用。而对黑曲霉菌、白色念珠菌的回收率均高于70%，说明无抑霉菌作用。

培养基稀释法:用培养基稀释法测定上述含抑菌成分的蒙药微生度的验证试验数据及回收率见表2。

表2 金莲花片稀释法

从表2可以看出，金莲花片对枯草芽孢杆菌的回收率低于70%，说明有抑菌作用，培养基稀释法不能消除该药的抑菌作用。

离心集菌薄膜过滤法:用离心集菌薄膜过滤法测定上述含抑菌成分蒙药微生物限度的验证试验结果见表3。

表3 金莲花片离心集菌薄膜过滤法

从表3可见回收率高于70%，表明离心集菌薄膜过滤法可用于该药的细菌数检查。

2.2 控制菌检查方法验证

2.2.1 大肠埃希菌的验证 菌液制备:同前菌液的制备，制备大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌菌液。

验证方法:试验组:取1:10供试液10mL及10～100CFU大肠埃希菌注入100mL胆盐乳糖培养基中，依大肠埃希菌检查法进行检查。阴性菌对照组:取1:10供试液10mL及10～100CFU金黄色葡萄球菌注入100mL胆盐乳糖培养基中，依大肠埃希菌检查法进行检查。

2.2.2 大肠菌群的验证菌液制备:同前菌液的制备，制备大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌菌液。

验证方法:试验组:取1:10供试液1mL、1:100供试液1mL、1:1000供试液1mL分别加入10mL胆盐乳糖发酵培养基管3支中，同时分别加入10～100CFU大肠埃希菌，依大肠菌群检查法进行检查。阴性菌对照组:取1:10供试液1mL、1:100供试液1mL、1:1000供试液 1mL分别加入10mL胆盐乳糖发酵培养基管3支中，同时分别加入10～100CFU金黄色葡萄球菌，依大肠菌群检查法进行检查。

2.2.3 试验结果:大肠埃希菌、大肠菌群检查方法验证结果见表4。

表4 常规法控制菌验证结果

2.2.4 结果判断:从表4可以看出，用常规法即可检查出大肠埃希菌、大肠菌群。

3 讨论

通过对本品细菌数、霉菌检查验证，确定该品种采用薄膜过滤法测定其细菌数，采用药典常规法可测定其霉菌数，采用药典常规法检查其控制菌。参考文献

［1］黄睿，张贵君，潘艳丽等.金莲花化学成分的HPLC－MS表征分析与鉴定〔J〕.中草药杂志，2012，43(4:)670－672

［2］杨宏昕，常亮，赵阳等.蒙药金莲花药理作用研究〔J〕.中国药业杂志2012，21(20):29－30

［3］国家药典委员会.中华人民共和国药典〔S〕.二部.2010，107－111