大孔树脂纯化显齿蛇葡萄黄酮的工艺研究△

孔庆童 付 明 胡 兴 王登宇

(民族药用植物资源研究与利用湖南省重点实验室;湘西药用植物与民族植物学湖南省高校重点实验室;怀化学院生命科学系，湖南 怀化 418008)

显齿蛇葡萄(Ampelopsis grossedentata)主要生长在我国江南山区的沟谷林中或山坡灌丛，属于葡萄科蛇葡萄属藤本植物。显齿蛇葡萄全株药用，具有清热解毒、祛风湿、强筋骨等功效，可治疗感冒发热、咽喉肿痛、黄疸型肝炎、疱疖等症［1－3］。民间将其制成藤茶(亦称“茅岩莓茶”、“甘露茶”等)饮用，可强身健体，并且在食品中也有应用［4］。

迄今为止，已在5000多种植物中发现了黄酮类化合物，而据有文献报道，显齿蛇葡萄中黄酮含量高达45%，主要是二氢杨梅素［5，6］，并且具有广泛的生理活性，可抑制机体内的氧化损伤，调节人体免疫机能;降低血糖血脂，用于防治糖尿病、动脉粥样硬化、高血脂等;同时具有护肝、抗血栓、抗病毒等作用［7，8］。

黄酮类化合物的纯化方法有纸层析法、重结晶法［9］、高效液相层析法［10］、柱层析法等，大孔树脂是不含离子基团的高分子聚合物吸附剂［11］，在生物碱、黄酮等成分的分离纯化领域中应用广泛，具有操作简便、再生容易、溶剂耗费少、回收率高等优点，分离纯化效果较好。根据现有条件选取大孔树脂层析法纯化显齿蛇葡萄黄酮，优化筛选最佳工艺条件，为今后进一步研究显齿蛇葡萄黄酮奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器:显齿蛇葡萄茎于2011年6月5日采自湖南省怀化市，将材料洗净、剪碎、烘干后粉碎，过60目筛，密封保存备用。

HPD100、HPD600、D101、DM130、AB －8 型大孔吸附树脂(沧州宝恩吸附材料科技有限公司)，二氢杨梅素(99%，张家界至诚生物有限公司)，AlCl3·6H2O、NaOH、HCl、无水乙醇、95%乙醇等均为分析纯。

岛津UV2450分光光度计、台式高速冷冻离心机(力康发展有限公司)、HL－1恒流泵(上海沪西分析仪器厂)、FA2004电子天平(上海衡平仪器仪表厂)、JY98－ⅢDN超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)、索氏提取器、DP01溶剂过滤器。

1.2 方法

1.2.1 配制溶液、活化大孔树脂:配制 0.1 mg·mL－1的二氢杨梅素对照品溶液、5%AlCl3、5%HCl、1mol·L－1NaOH等。将各种树脂进行酸处理→碱处理→醇处理［12］，备用。

1.2.2 提取样品黄酮［13］:称取2.5 g 样品加入适量石油醚于索氏提取器中回流脱脂，弃石油醚、风干，然后加入50 mL 65%的乙醇于65℃浸提2 h，超声波处理25 min，8000 rpm离心5 min。收集上清液;向沉淀中再加入50 mL 65%的乙醇，超声波处理25 min，再离心。合并上清液即得显齿蛇葡萄黄酮粗提液，将粗提液抽滤后用65%乙醇定容至100 mL，备用。

1.2.3 确定最大吸收波长、建立标准曲线:取二氢杨梅素对照品溶液、样品黄酮提取液、蒸馏水各1 mL，分别加入3 mL 5%的AlCl3，用65%的乙醇定容至10 mL，显色10 min后于200～400 nm扫描，确定二者共同的最大吸收波长。分别取二氢杨梅素对照品 0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mL，如上所述在最大吸收波长处测吸光值，以吸光值对二氢杨梅素浓度绘制标准曲线。

1.2.4 测定样品黄酮的含量:取一定体积的黄酮提取液如

1.2.3 所述测吸光值。根据吸光值通过回归方程求出X，再按公式(2.1)计算黄酮的质量分数:

X:由标准曲线得出的二氢杨梅素浓度;n:稀释倍数;V:提取液体积，mL;w:样品质量，g。

1.2.5 静态试验［14，15］:吸附性能考察:将 5 种活化后的树脂分别称取5 g于250 mL锥形瓶，加入100 mL样品提取

解吸性能考察:弃去静态吸附试验中的上清液，用滤纸吸干树脂表面的液体，将之平分为5等份，分别加入15%、35%、55%、75%、95% 乙醇100 mL，摇床振荡12 h，静置3 h后按1.2.4方法测上清液的吸光值，计算出上清液中的黄酮质量分数和静态解吸率，筛选洗脱剂的最佳体积分数。液，避光、密封振摇24 h。然后取上清液按1.2.4方法测吸光值、计算上清液中黄酮的质量分数，筛选吸附性能最佳的树脂型号。

1.2.6 动态试验

动态吸附率

制备一系列不同浓度的样品溶液，取一定体积上柱，吸附一定时间后以一定的流速先用蒸馏水洗至无黄酮流出，再用不同体积分数的乙醇洗脱，分别收集洗脱液，并测其吸光值。在其他条件相同时，以其中一个为变量，分别筛选最佳上样浓度、上样体积、吸附时间和洗脱速度。

2 结果与分析

2.1 最大吸收波长、标准曲线及回归方程:对二氢杨梅素对照品和样品提取液进行扫描，结果显示两者在310 nm处有最大光吸收，因此取不同浓度的对照品测A310，以A310对二氢杨梅素浓度作图，得线性回归方程y=55.14795x，r=0.9998，说明在0 ～15μg·mL－1浓度范围内线性关系良好。

2.2 显齿蛇葡萄黄酮的含量:根据样品液的吸光值通过回归方程计算出黄酮的浓度，测得样品提取液的A310=0.380，浓度为 689.1 μg·mL－1，根据公式(1)计算出显齿蛇葡萄茎中黄酮含量为2.76%。

2.3 静态试验结果:5种不同型号树脂的静态吸附量、吸附率结果见表1，静态解吸率结果如图1所示:

表1 不同树脂对显齿蛇葡萄黄酮的吸附率

图1 五种树脂的静态解吸结果

由表1可知，HPD100型树脂对样品黄酮的吸附率高于其他4种树脂，其次是D101型及AB－8型树脂。从图1可知，洗脱剂的体积分数对黄酮的解吸率有明显的影响，随着体积分数的增加，解吸率也逐渐增加，故洗脱剂的最佳体积分数为95%;当洗脱剂体积分数达95%时，HPD100、DM130型的黄酮解吸率最高，但DM130树脂的吸附性能较差，故选用HPD100型树脂进行动态实验。

2.4 动态试验结果

2.4.1 上样浓度的优化:将样品提取液配制成137.8、172.3、229.7、344.6、689.1μg·mL－1系列浓度的上样液，各取5 mL上柱，按1.2.6的方法操作，计算不同上样浓度黄酮的吸附率、洗脱率及回收率，结果如图2。

图2 上样浓度对吸附率、洗脱率和回收率的影响

由图2可知，随着上样液的浓度增加，对黄酮的吸附率减少，洗脱率和回收率也减小，故上样液的最佳浓度为137.8μg·mL－1。

2.4.2 上样体积的优化:选择浓度为 137.8μg·mL－1的样品液，分别上样3、4、5、6、7mL，吸附30 min 后按2.4.1 方法洗脱、收集，测A310。计算不同上样体积下黄酮的吸附率、洗脱率及回收率，结果如图3。

图3 上样体积对吸附率、洗脱率和回收率的影响

由图3可知，随着上样体积的增大，对黄酮的吸附率并没有明显变化。而黄酮的洗脱率和回收率随体积增大先增大后减小，且在上样体积为5.0 mL时有最大值，之后开始下降。主要是因为上样量加大，蒸馏水洗出的黄酮量也增加，故最佳上样体积为5 mL。

2.4.3 吸附时间的优化:取 137.8μg·mL－1的样品液 5 mL，上柱平衡，分别吸附 7 min、15 min、30 min、60 min 后，按2.4.1方法洗脱、收集，测A310。计算不同吸附时间下黄酮的吸附率、洗脱率及回收率，结果如图4。

图4 吸附时间对吸附率、洗脱率和回收率的影响

由图4可知，随着吸附时间的增长，树脂对黄酮的吸附率也增大;但在30 min前黄酮的洗脱率和回收率增加，30 min后洗脱率和回收率降低，当吸附时间为30 min时洗脱率和回收率最高;吸附时间为60 min时吸附率最大，但是洗脱率、回收率最低。吸附时间过短会导致吸附不完全，而吸附时间过长又导致解吸困难，因此确定最佳吸附时间为30 min。

2.4.4 洗脱速度的优化:取 5 mL、137.8μg·mL－1样品液上柱、平衡，吸附 30 min 后，分别以 0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 mL/min流速，先用蒸馏水再用95% 乙醇洗脱，分别收集洗脱液，测A310。计算不同吸附时间下黄酮的吸附率、洗脱率及回收率，结果如图5。

图5 洗脱速度对吸附率、洗脱率和回收率的影响

由图5可知，洗脱速度对黄酮的吸附率没有明显影响，但是对洗脱率和回收率有明显影响。随洗脱流速的增大，洗脱率和回收率先增大后减小，且在1 mL/min时有最大值。当流速为1.0 mL/min和1.5 mL/min时，洗脱率和回收率非常接近;流速过低或过高时黄酮的洗脱率都很低，为节省时间、提高生产效率，选择最佳洗脱速度为1.5 mL/min。

2.5 验证性试验:将已活化的HPD100型树脂湿法装柱、平衡，在最优条件下(上样液中黄酮的浓度为137.8μg·mL－1，上样体积 5 mL，吸附 30 min，洗脱速度 1.5 mL/min)做3组平行试验，结果表明树脂对显齿蛇葡萄茎中黄酮的平均吸附率85.44%，洗脱率94.92%，回收率95.66%，纯化后样品的黄酮质量分数达81.1%，工艺结果基本稳定，可用于工业纯化。

3 讨论

黄酮类化合物的溶解度因结构、存在状态不同因此有很大差异，一般游离态苷元难溶于水，易溶于甲醇、乙醇等有机溶剂，其中黄酮醇、查尔酮等难溶于水;而二氢黄酮、二氢黄酮醇等在水中的溶解度稍大［8］。乙醇毒性较小，可回收利用，因此选用乙醇来提取显齿蛇葡萄中的黄酮并用其作为洗脱剂。

根据黄酮类化合物本身具有的荧光性质，可用荧光分析法直接测定显齿蛇葡萄中黄酮的含量［16］;由于黄酮类化合物与三价铝离子能形成稳定的荧光络合物，在紫外区内有特征吸收峰，也可在显色后用分光光度法测定黄酮的含量。很多文献以芦丁为对照品测黄酮的含量，但我们进行波长扫描时，发现芦丁和样品没有共有的最大吸收峰，而以二氢杨梅素为对照品时，有共有特征峰。虽然样品与对照品的波长扫描图有些不同，主要是因为样品中含有多种黄酮类化合物。本实验采用三氯化铝显色法测定显齿蛇葡萄的黄酮含量。

静态吸附实验中吸附率较低，可能是因为加入的样品提取液过多，树脂已达饱和。近些年，也有采用大孔树脂法纯化显齿蛇葡萄黄酮的工艺研究，他们用70% 乙醇作为洗脱剂，洗脱不彻底，所以洗脱率和回收率都没有达到本实验的95%。且95% 乙醇易于回收，浓缩干燥迅速、方便，故工业上用95% 乙醇洗脱是可行的。

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