骨髓间充质干细胞向人胶质瘤迁移的分子机制初探

胡宜，程鹏，薛一雪，刘云会

（中国医科大学1.附属盛京医院神经外科，沈阳110004；2.附属第一医院神经外科，沈阳 110001；3.基础医学院神经生物学教研室，沈阳110001）

胶质瘤是最常见的颅内恶性肿瘤，极易复发［1］。胶质瘤患者接受外科手术切除后，平均生存期限仅为6个月，2年生存率不足7.5%［2］。近年来，针对胶质瘤的细胞受体、关键基因以及调节蛋白的靶向基因治疗受到关注［3］。在其靶向治疗中，寻找能将治疗药物或基因运送到肿瘤部位的载体很重要。目前，存在于骨髓中的非造血性干细胞——骨髓间充质干细胞（bone marrow⁃derived mesenchymal stem cells，BMSCs），因其具有向胶质瘤的趋化迁移能力而引起人们的注意［4～6］。该特性使得骨髓间充质干细胞可以作为胶质瘤基因治疗的合适载体。然而，BMSCs向胶质瘤定向迁移的机制仍不明确，探明其向胶质瘤趋化的分子生物学机制有助于提高BM⁃SCs的迁移效率，为进一步合理的临床应用提供理论基础。

目前，在BMSCs向胶质瘤迁移的机制研究中，多认为肿瘤细胞会分泌多种趋化因子吸引其迁移。然而涉及BMSCs表面标志物及其下游信号通路的研究非常有限。本研究通过调查胶质瘤细胞对BMSCs表面黏附分子——血管细胞黏附分子⁃1（vascular cell adhesion molecule⁃1，VCAM⁃1）表达的影响及其在BMSCs向胶质瘤迁移过程中的作用以及下游信号传导通路，探讨BMSCs向胶质瘤趋化迁移分子生物学机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

Dulbecco′s modified Eagle medium（DMEM）低糖培养基及优级胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自美国Gibco公司，小鼠抗大鼠VCAM⁃1单克隆阻滞抗体（MMS⁃141P）购买于美国Covance公司。Trizol试剂购自加拿大Invitrogen公司，cDNA合成试剂盒购自TaKaRa生物科技公司［RNA PCR Kit（AMV）ver 3.0］。兔抗大鼠VCAM⁃1多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司。Radio immunoprecipitation assay（RIPA）裂解液及BCA试剂盒购自碧云天生物科技公司。罗丹明标记的山羊抗兔荧光二抗购于美国Santa Cruz公司。吉姆萨染液购自北京索莱宝科技有限公司。磷脂酰肌醇⁃3⁃激酶（phosphoinositide⁃3⁃kinase，PI3K）信号通路抑制剂LY294002购自美国Cell Signal Technology公司。

1.2 细胞培养

骨髓间充质干细胞采用全骨髓贴壁法分离培养［7，8］。取材对象为 4～6 周龄健康 Sprague⁃Dawley（SD）大鼠，体质量60～80 g，由中国医科大学实验动物部提供。脱颈处死大鼠，浸入75%乙醇浸泡5 min，超净台内无菌条件下取双侧股骨和胫骨，剪去骨骺端，以含10%血清的DMEM低糖培养基冲洗骨髓腔3次。以1 mL注射器针头过滤，吹打成单细胞悬液并接种于含10%胎牛血清的DMEM培养基的75 cm2培养瓶中，在含5%CO2的培养箱中37℃条件下培养。48 h后首次换液，以后每72 h换液。12～14 d后，细胞生长至80%～90%融合，以0.25%胰酶消化，然后以1∶2传代，之后约5～7 d再次传代，使用第2～4代细胞进行下一步实验。胶质瘤细胞株采用人U251胶质瘤细胞，由中国医科大学神经生物学教研室提供，用含10%胎牛血清的DMEM低糖培养基进行培养，条件同样为37℃，5%CO2。

1.3 骨髓间充质干细胞体外迁移模型的建立

骨髓间充质干细胞体外迁移模型利用24孔板、Transwell小室（聚碳酸酯膜，孔径为8μm，型号3422，购自Coning Costar公司）。分为实验组，VCAM⁃1阻断组及对照组。实验组中人U251胶质瘤细胞以无血清L⁃DMEM培养基重悬，将5×105/mL密度的U251细胞悬液0.5 mL接种于24孔板小孔内。培养4 h后，待U251细胞完全贴壁后，Transwell小室内接种密度为1×106/mL的BMSCs悬液0.2 mL，培养24 h。对照组的24孔板小孔内放置同体积的不含细胞的无血清培养基。VCAM⁃1阻断组则在上室加入VCAM⁃1特异性阻断单克隆抗体（Covance，10 μg/mL）或磷脂酰肌醇⁃3⁃激酶（PI3K）信号通路抑制剂 LY294002（10 μmol/L）。培养 24 h后，取出Transwell小室，用无菌棉棒轻擦去聚碳酸酯膜上表面的细胞，利用磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solu⁃tion，PBS）漂洗1次，甲醇∶冰乙酸（3∶1）固定30 min，吉姆萨染液（工作液∶稀释液为9∶1）染色15 min。甩去染液，自来水冲洗2次，光镜下观察计数迁移到聚碳酸酯膜下表面的细胞。每组6孔，每孔计数6个随机400×视野内的细胞数，然后迁移能力以迁移指数（migration index）表示［9］。所得数据采用±s表示。

1.4 逆转录PCR（RT⁃PCR）

第三代培养的BMSCs细胞在U251细胞上清中培养24 h。加入LY294002（30 μmol/L）。无血清培养基作为对照组。总RNA按照说明书，利用Trizol提取。cDNA的反转录反应利用TaKaRa的PCR Kit（AMV）ver 3.0，加入500 ng的总RNA。PCR采用的引物序列为 5′⁃ACACCTCCCCCAAGAATACAG⁃3′（forward）和5′⁃GC TCATCCTCAACACCCACAG⁃3′（reverse），扩增片段长度为477 bp。PCR反应条件体系为94℃变性30 s，63℃退火30 s，72℃延伸1 min。进行32次循环。PCR的产物采用含溴化乙锭的1%琼脂糖凝胶电泳，然后在紫外线下发光，并计算目的基因与β⁃actin的积分光密度比值并进行数学统计。

1.5 蛋白印迹（Western blot）

BMSCs以预先冰冷的PBS冲洗3次，然后利用细胞刮刀收集于离心管中，加入适量RIPA裂解液（碧云天），冰上裂解30 min，然后超声粉碎。4℃条件下以14 000 g离心5 min，含有蛋白的上清被收集到新管中。利用BCA法测定蛋白浓度。蛋白上样量为25 μg，利用10%SDS⁃polyacrylamide gel electro⁃phoresis（PAGE）凝胶电泳进行蛋白分离。转膜后以兔抗大鼠的VCAM⁃1多克隆抗体及小鼠抗大鼠β⁃actin多克隆抗体封闭过夜。山羊抗小鼠及抗兔的辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1 h，利用ChemiImager 5500 V2.03软件检测，并测定积分光密度值，计算目的基因与β⁃actin的积分光密度相对比值并进行数学统计。

1.6 统计学分析

统计学分析利用SPSS统计学软件（版本为13.0）进行，并经过配对t检验验证；多组间差异经过Bonferroni检验，均计算P值。以P＆lt;0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养

原代取材3 d后即可观察到贴壁细胞。5 d形成集落（图1A）。12～14 d生长至80%～90%融合，呈旋涡状、铺路石状（图1B）。传代后大约5～7 d再次生长至90%融合，可进行再次传代。吉姆萨染色下显示第3代BMSCs细胞形态比较均一，呈有突起的长梭型（图1C）。

图1 BMSCs形态Fig.1 The morphology of BMSCs

2.2 VCAM⁃1及PI3K信号通路在BMSCs向人胶质瘤细胞的迁移中发挥作用

与对照组相比，在Transwell体外迁移系统中，U251胶质瘤细胞强烈的吸引BMSCs的迁移（图2A，2B）。加入VCAM⁃1特异性阻断单克隆抗体后，与U251组相比，发生迁移的BMSCs细胞数量显著减少（图2C），迁移的细胞数量差异有统计学意义（图2E）（P＆lt;0.05）。为了进一步探明BMSCs发生迁移的信号传导机制，加入了PI3K信号通路抑制剂LY294002。结果显示与U251组相比，迁移到半透膜下表面的BMSCs细胞数量同样明显减少，差异有统计学意义（图2E）（P＆lt;0.05）。

图2 U251胶质瘤细胞诱导BMSCs的迁移被VCAM⁃1阻滞抗体及LY294002抑制Fig.2 U251 glioma cells induced migration of BMSCs was impaired by blocking antibody against VCAM⁃1 and LY294002

2.3 U251胶质瘤细胞上调BMSCs的VCAM⁃1核酸及蛋白表达

利用RT⁃PCR及Western blot方法检测U251胶质瘤细胞对BMSCs的VCAM⁃1核酸及蛋白的表达影响。RT⁃PCR结果显示：与无血清对照组相比，U251细胞上清显著增强了BMSCs的VCAM⁃1的mRNA表达（图3A）。Western blot结果同样显示，在U251细胞培养上清的诱导下，BMSCs的VCAM⁃1蛋白质的表达水平明显升高（图3B），表达差异有统计学意义（图3C）。

图3 PI3K信号通路在U251胶质瘤细胞调控BMSCs的VCAM⁃1表达中的作用Fig.3 The role of PI3K pathway in the regulation of VCAM⁃1 expression on BMSCs by U251 glioma cells.

2.4 PI3K信号通路调控BMSCs的VCAM⁃1表达

为了探明U251胶质瘤细胞对BMSCs的VCAM⁃1表达调控中的信号传导通路，在U251细胞培养上清诱导的同时加入PI3K通路抑制剂LY294002（30μ mol/L）。结果显示，加入LY294002后，被胶质瘤细胞上调的VCAM⁃1蛋白质及核酸表达均受到显著抑制（图3A、3B），差异有统计学意义（图3C）（P＆lt;0.05）。

3 讨论

本研究首先成功分离并以全骨髓法培养BM⁃SCs，结果显示其易于体外扩增，细胞形态比较均一，呈典型的集落样生长，形态符合文献中报道［6］。我们的研究首先证实BMSCs在体外具有向人U251胶质瘤细胞迁移的能力，然后观察到U251胶质瘤细胞诱导的BMSCs迁移可被VCAM⁃1特异性单克隆阻断抗体或PI3K信号通路抑制剂LY294002所抑制，明确了细胞表面粘附分子VCAM⁃1以及PI3K信号通路在BMSCs向胶质瘤细胞的迁移中发挥作用。同时发现胶质瘤细胞可显著上调BMSCs的VCAM⁃1核酸及蛋白表达，而PI3K信号通路抑制剂LY294002可抑制VCAM⁃1的表达上调及BMSCs的迁移能力。以上结果说明胶质瘤细胞可能通过促进BMSCs表达细胞表面粘附分子而诱导其迁移，同时在这一过程中PI3K信号通路发挥作用。

由于胶质瘤的恶性浸润性生长方式，传统的肿瘤全切以及术后放化疗等仍无法完全根除并防止其复发。在此背景下，基因靶向治疗成为热点。BMSCs是来自于中胚层、存在于骨髓中的非造血干细胞，除多向分化潜能外，还具有免疫调节活性［10，11］。另一方面，BMSCs向肿瘤的趋向迁移已引起人们的关注［12，13］。有学者认为，BMSCs向肿瘤的趋向性具有特异性及普遍性，是其作为干细胞的一个内在特点［14］。BMSCs容易分离提取，体外培养扩增方便，具有高度可塑性，免疫相容性好，被认为是组织工程和细胞移植治疗中的理想细胞［15］。利用BMSCs的向肿瘤的趋化特性，将基因转换技术及细胞移植结合起来，有可能使其成为理想的基因治疗载体。然而BMSCs的这种向胶质瘤细胞的迁移特性的机制目前仍不明确。肿瘤细胞会分泌多种与炎性细胞趋化相关的细胞因子，如内皮细胞生长因子、转化生长因子、成纤维细胞生长因子等［16］。生长因子类对BMSCs有较强趋化作用，例如血小板源性生长因子⁃BB是较强烈吸引BMSCs迁移的因子［4］。但目前关于BMSCs本身及细胞标志物、受体及下游信号通路在其向胶质瘤的迁移中的变化，则未见报道。

黏附分子是一类重要的糖蛋白，介导白细胞及内皮细胞间的黏附及迁移。目前，对BMSCs的细胞表面黏附分子表达情况研究很少。作为一类重要的细胞表面黏附分子，VCAM⁃1参与调节白细胞向微血管内皮的迁移及附着［17，18］。有研究指出VCAM⁃1 及其受体α4β1 整合素表达于 BMSCs［19，20］，同时VCAM⁃1在BMSCs向心血管内皮的迁移中也发挥作用［21］。因此我们推测在BMSCs向人胶质瘤细胞的迁移中，VCAM⁃1同样可能发挥作用。在体外迁移模型中，Transwell上室内加入浓度为10 μg/mL的VCAM⁃1特异性单克隆阻滞抗体后，U251胶质瘤细胞引起的BMSCs迁移数量明显减少，说明阻滞VCAM⁃1后BMSCs的向胶质瘤迁移能力显著减弱。在此基础上，我们又进一步研究了胶质瘤细胞对BMSCs的VCAM⁃1表达调控。RT⁃PCR及Western blot研究结果显示，U251人胶质瘤细胞的培养上清诱导可显著促进BMSCs的VCAM⁃1 mRNA及蛋白的表达。磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphoinositide⁃3⁃ki⁃nase，PI3K）信号通路在细胞存活、增殖、趋化等重要的细胞生命活动中发挥作用，并与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关［22，23］。Forte等［24］报道PI3K与肝细胞生长因子介导的BMSCs迁移有关。另有报道指出PI3K通路参与人类内皮细胞的VCAM⁃1表达调控［26，25］。在本研究中，我们发现PI3K信号通路抑制剂LY294002明显抑制BMSCs向U251胶质瘤细胞的迁移能力，同时可以抑制被胶质瘤细胞上调的黏附分子的mRNA及蛋白表达，说明在胶质瘤调控BMSCs的VCAM⁃1表达过程中PI3K信号通路发挥重要作用。

上述结果表明，在胶质瘤细胞的作用下BMSCs可能通过上调表达细胞表面黏附分子VCAM⁃1而促进其向胶质瘤定向迁移，并且在该过程中的下游信号传导通路为PI3K信号通路，这可能是BMSCs向肿瘤的趋化迁移的机制之一。

［1］Sanai N，Berger MS.Glioma extent of resection and its impact on pa⁃tient outcome［J］.Neurosurgery，2008，62（4）：753-766.

［2］Siebzehnrub FA，Reynol BA，Vescovi A，et al.The origins of glioma：E Pluribus Unum?［J］.Glia，2011，59（8）：1135-1147.

［3］Ryu CH，Park S⁃H，Park SA，et al.Gene therapy of intracranial glio⁃ma using interleukin 12⁃secreting human umbilical cord blood⁃de⁃rived mesenchymal stem cells［J］.Hum Gene Ther，2011，22（6）：733-743.

［4］Cheng P，Gao ZQ，Liu YH，et al.Platelet⁃derived growth factor BB promotes the migration of bone marrow⁃derived mesenchymal stem cells towards C6 glioma and up⁃regulates the expression of intracel⁃lular adhesion molecule⁃1［J］.Neurosci Lett，2009，451（1）：52-56.

［5］Yang B，Wu X，Mao Y，et al.Dual⁃targeted antitumor effects against brainstem glioma by intravenous delivery of tumor necrosis factor⁃elated，apoptosis⁃inducing，ligand⁃engineered human mesenchymal stem cells［J］.Neurosurgery，2009，65（3）：610-624.

［6］Bexell D，Gunnarsson S，Tormin A，et al.Bone marrow multipotent mesenchymal stroma cells act as pericyte⁃like migratory vehicles in experimental gliomas［J］.Mol Ther，2009，17（1）：183-190.

［7］Snykers S，Vanhaecke T，Rogiers V.Isolation of rat bone marrow stem cells［J］.Methods Mol Biol，2006，320：265-272.

［8］Tohill M，Mantovani C，Wiberg M，et al.Rat bone marrow mesenchy⁃mal stem cells express glial markers and stimulate nerve regenera⁃tion［J］.Neurosci Lett，2004，362（3）：200-203.

［9］Haasters F，Prall WC，Westphal I，et al.Overexpression of dnIKK in mesenchymal stem cells leads to increased migration and decreased invasion upon TNFα stimulation［J］.Biochem Biophys Res Com⁃mun，2013，436（2）：265-270.

［10］Sasser AK，Sullivan NJ，Studebaker AW，et al.Interleukin⁃6 is a potent growth factor for ER⁃alpha⁃positive human breast cancer［J］.Faseb J，2007，21（13）：3763-3770.

［11］Sasportas LS，Kasmieh R，Wakimoto H，et al.Assessment of thera⁃peutic efficacy and fate of engineered human mesenchymal stem cells for cancer therapy［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2009，106（12）：4822-4827.

［12］Karnoub AE，Dash AB，Vo AP，et al.Mesenchymalstem cells with⁃in tumour stroma promote breastcancer metastasis［J］.Nature，2007，449（7162）：557-563.

［13］Hall B，Andreeff M，Marini F.The participation of mesenchymal stem cells in tumor stroma formation and their application as tar⁃geted⁃gene delivery vehicles［J］.Handb Exp Pharmacol，2007，180：263-283.

［14］Nakamizo A，Marini F，Amano T，et al.Human bone marrow⁃derived mesenchymal stem cells in the treatment of gliomas［J］.Cancer Res，2005，65（8）：3307-3318.

［15］Hong X，Cathie M，Smita SB，et al.Antitumor treatment using inter⁃leukin⁃12⁃secreting marrow stromal cells in an invasive glioma model［J］.Neurosurgery，2009，64（6）：1139-1147.

［16］Nakamura K，Ito Y，Kawano Y，et al.Antitumor effect of genetical⁃ly engineered mesenchymal stem cells in a rat glioma model［J］.Gene Ther，2004，11（14）：1155-1164.

［17］Hyun YM，Chung HL，McGrath JL，et al.Activated integrin VLA⁃4 localizes to the lamellipodia and mediates T cell migration on VCAM⁃1［J］.J Immunol，2009，183（1）：359-369.

［18］Yilmaz G，Granger DN.Leukocyte recruitment and ischemic brain injury［J］.Neuromolecular Med，2010，12（2）：193-204.

［19］Rosenman SJ，Shrikant P，Dubb L，et al.Cytokine⁃induced expres⁃sion of vascular cell adhesion molecule⁃1（VCAM⁃1）by astrocytes and astrocytoma cell lines［J］.J Immunol，154（4）：1888-1889.

［20］Mäenpää A，Kovanen PE，Paetau A，et al.Lymphocyte adhesion molecule ligands and extracellular matrix proteins in gliomas and normal brain：expression of VCAM⁃1 in gliomas［J］.Acta Neuro⁃pathol，1997，94（3）：216-225.

［21］Segers VFM，van Riet I，Andries LJ，et al.Mesenchymal stem cell adhesion to cardiac microvascular endothelium：activators and mechanisms［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2006，290（4）：H1370-H1377.

［22］Karar J，Maity A.PI3K/AKT/mTOR pathway in angiogenesis［J］.Front Mol Neurosci，2011，4：51-51.

［23］Scrima M，Marco C De，Fabiani F，et al.Signaling networks associ⁃ated with AKT activation in non⁃small cell lung cancer（NSCLC）：New insights on the role of phosphatydil⁃inositol⁃3 kinase［J］.PloS One，2012，7（2）：e30427.

［24］Forte G，Minieri M，Cossa P，et al.Hepatocyte growth factor effects on mesenchymal stem cells：proliferation，migration，and differenti⁃ation［J］.Stem Cells（Dayton，Ohio），2006，24（1）：23-33.

［25］Tsoyi K，Jang HJ，Nizamutdinova IT，et al.PTEN differentially reg⁃ulates expressions of ICAM⁃1 and VCAM⁃1 through PI3K/Akt/GSK⁃3beta/GATA⁃6 signaling pathways in TNF⁃alpha⁃activated human endothelial cells［J］.Atherosclerosis，2010，213（1）：115-121.

［26］Ward SG，Westwick J，Harris S.Sat⁃Nav for T cells：Role of PI3K isoforms and lipid phosphatases in migration of T lymphocytes［J］.Immunol Lett，2011，138（1）：15-18.