应用导入HSVtk基因的骨髓间充质干细胞治疗胶质瘤的实验研究

李少一，高芸，刘宏宇，郭文昌，王国栋，李晓东，马维宁，刘云会

（中国医科大学1.附属盛京医院神经外科，沈阳 110004；2.附属第一医院内分泌研究所，沈阳 110001）

尽管现代诊断技术和治疗方法有了很大的提高，作为最常见、恶性程度最高的原发脑肿瘤——胶质母细胞瘤，其预后仍非常差。从诊断之日起计算，患者的中位生存期大致为1年，并且近30多年来没有明显改善［1］。尽管应用HSVtk基因和更昔洛韦（ganciclovir，GCV）的自杀基因疗法已经得到临床证实［2］，但是结果并不令人满意。部分是因为由纤维母细胞衍生而来的载体细胞的迁移活动具有局限性，使其不能广泛覆盖已经浸润到周围脑组织的胶质瘤细胞。为了增强效应细胞的迁移活动，许多研究报道［3～5］了以神经干细胞和骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC）作为载体，两种细胞对包括胶质瘤及各种脑损伤都表现出较强的趋向性。同时也有研究发现，在BMSCtk和C6大鼠胶质瘤细胞之间存在极强的旁观者效应［6］。这些研究资料表明，作为治疗胶质母细胞瘤一项新的方法，“BMSCtk疗法”是很有前景的。

HSVtk阳性细胞与阴性细胞之间的旁观者效应已经得到深入的研究，尤其是在细胞间通讯方面。同时，在体外实验中发现，BMCStk与C6细胞之间的旁观者效应也是非常强的［6］。本研究我们观察在体外条件下，人BMSCtk细胞与人和大鼠脑胶质瘤细胞之间的旁观者效应，并观察各种胶质瘤细胞培养上清对BMSCtk的趋化作用。

1 材料和方法

1.1 人BMSCtk细胞的制备

人BMSC细胞和人BMSC细胞培养液购自康伯司生物科学公司。复制缺陷型HSVtk逆转录病毒的PA317包装细胞由Genetic Therapy公司提供。将PA317细胞在培养基中培养48 h，取上清液储藏于-80℃的环境中备用。在25 cm2的培养瓶内，以5×103/cm2的密度接种BMSC细胞，培养24 h之后，在3 mL的新鲜培养液和1 mL的HSVtk逆转录病毒上清液（含有8 μg/mL的Polybrene）继续培养5 h，然后更换细胞培养液。应用150 μg/mL的G418（Sigma⁃Aldrich）进行1周耐药性筛选后，收集存活的耐药性细胞（BMSCtk细胞）用于后续实验。

1.2 大鼠BMSCtk细胞的制备

大鼠BMSC细胞取自6周龄的SD大鼠，用连接23G针头的5 mL注射器从大鼠的股骨和胫骨抽吸骨髓，悬浮于鼠BMSC培养液（Stem Cell Technolo⁃gies Inc.Mesencult®）中。所有骨髓细胞通过70 μm的尼龙细胞过滤器滤过，并以5×103/cm2的密度播种于10 cm的培养盘中。24 h后更换培养液，此后2～3 d更换1次。除了使用鼠BMSC培养液以外，HSVtk基因的转移和药物耐药性选择的方法与前述人BM⁃SC的方法相同。制备成功的大鼠BMSCtk细胞用于后续实验。

1.3 BMSCtk细胞和各种胶质瘤细胞株之间的旁观者效应检测

人胶质母细胞瘤细胞株（A⁃172、YKG⁃1、T98G）、人髓母细胞瘤细胞株（Daoy、TE671）和大鼠胶质瘤细胞株（C6、9L）购自ATCC公司。分别将上述7种胶质瘤细胞与相同数量的人或大鼠BMSCtk细胞共培养于含有或不含有1 μg/mL的GCV的培养液中，播种于96孔培养板上。对照组为5×103肿瘤细胞单独培养于含有或不含有GCV的培养液中。条件培养液每2天更换1次，并在第7天用MTT分析法检测存活的细胞数量。以测定结果相对于培养在不含有GCV的培养液中的肿瘤细胞的吸光百分比作为评价其抗肿瘤活性的指标。

1.4 体外迁移实验

我们用24孔Matrigel小室（BD Biosciences）来评价BMSC的趋化迁移能力。人BMSC细胞用条件培养液（不含10%FBS，含1%BSA）重悬细胞后制成1×105/mL的细胞悬液，按每室0.5 mL接种于Matrigel侵袭室的上层，每组3个复孔。下室放入0.75 mL不同胶质瘤细胞的条件培养基，继续培养36 h，取出上层的小室，去除基质膜上未侵袭转移细胞，以Diff⁃Quik试剂盒染色穿膜细胞后在200倍显微镜下计数穿膜细胞数。

1.5 统计学处理

采用SPSS 11.0统计软件进行Fisher确切概率法检验，P＆lt;0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体外实验中人BMSCtk细胞和各种胶质瘤细胞株之间的旁观者效应

无论是人还是大鼠的胶质瘤细胞，当与人BM⁃SCtk细胞共同培养，并在GCV（1 μg/mL）存在时，其细胞增殖活性较没有GCV时显著受到抑制（图1，P＆lt;0.01）。这表明，人BMSCtk细胞与不同种属和类别的胶质瘤细胞之间存在一种明显的旁观者效应。而当没有GCV存在时，人BMSCtk对于胶质瘤细胞的增殖没有明显的抑制效应。

图1 人BMSCtk细胞和不同胶质瘤细胞之间的旁观者效应Fig.1 Bystander effect between human BMSCtk and various glioma cells

2.2 体外实验中大鼠BMSCtk细胞和各种胶质瘤细胞株之间的旁观者效应

在大鼠BMSCtk细胞与各种胶质瘤细胞之间也观察到明显的旁观者效应（图2）。结果表明，在体外实验中，由大鼠BMSCtk细胞和GCV所引发的旁观者效应不具有胶质瘤细胞类型和种属特异性。

图2 大鼠BMSCtk细胞和不同胶质瘤细胞之间的旁观者效应Fig.2 Bystander effect of rat BMSCtk on various type of glioma cells

2.3 体外实验中胶质瘤条件培养基对人BMSCtk细胞的趋化作用

人BMSCtk细胞的迁移能力通过体外迁移实验来评估。当Matrigel小室下室由条件培养基（即各种胶质瘤细胞系的培养液）填充时，人BMSCtk细胞能活跃地通过人工基膜基底层和微孔，而当Matrigel小室下室由新鲜DMEM培养基填充时，则人BMSCtk细胞很少有迁移活动（图3）。

图3 人BMSCtk细胞体外迁移能力Fig.3 In vitro migratory capacity of human BMSCtk cells

3 讨论

在HSVtk/GCV自杀基因疗法中，“旁观者效应”介导的抗肿瘤活性已经受到了广泛的关注和证实。而在这个系统中，如何选择一个合适的载体将tk基因携带到肿瘤细胞周围成为一个关键问题。在以往的实验中，我们使用从SD大鼠胚胎脑中分离并培养的神经干细胞作为tk表达细胞，探讨了它们在胶质瘤治疗中的应用。将C6细胞与不同数量的tk神经干细胞混合后培养在含有1 μg/mL GCV的DMEM培养液中，观察到了极强的抗肿瘤活性［5］。为了将来在临床中有效地应用这一治疗方案，本研究选用了骨髓间充质干细胞这一可能从患者自身提取的细胞作为载体。结果发现在更昔洛韦的存在下，人类BMSCtk细胞对胶质瘤细胞具有很显著的体外抗肿瘤活性。与新鲜培养基比较，从人类和大鼠胶质瘤细胞获得的条件培养基都可以增强人BMSC向胶质瘤细胞的迁移活性。

在目前的研究中，我们使用和肿瘤细胞等量的BMSCtk细胞（BMSCtk细胞/肿瘤细胞=1∶1）。我们之前以不同比例混合C6细胞和BMSCtk细胞（从1∶1到1∶128混合BMSCtk细胞/肿瘤细胞）或转导了神经干细胞的HSVtk细胞来检测旁观者效应的强度，该研究表明BMSCtk细胞/肿瘤细胞的比例为1∶16时能产生非常强效的旁观者效应［6］。将来的研究中，我们应当对不同的BMSCtk细胞/肿瘤细胞组合进行一项针对其组成比例的剂量反应研究。由于这项研究的目的在于检测细胞类型和种属特异性，所以当前我们只进行了共植实验研究。很显然，同之前的治疗研究一样，我们需要在进一步的研究中检测已构建的颅内肿瘤模型中的这种旁观者效应。

本实验中，我们仍然采用的是商用人类BMSC细胞来作为运载细胞。这样一来，目前的研究就存在一种局限性：商用人类BMSC细胞并不能代表从患者身上获得的普通BMSC细胞。它们可能不会像干细胞那样表现出多重分化能力，显然，我们需要做更多的研究，以构建出理想的载体细胞，供临床使用。研究表明，构建并广泛应用于神经重组科学领域的诱导多能干细胞也能成为基因疗法中合适的载体细胞［7］。研究证实，诱导的多能干细胞在脑肿瘤条件培养液中存在强效的迁移活动，而这种活动也不具有肿瘤细胞类型特异性或种属特异性［8，9］。

为了方便临床应用，如果预先制备的同种异体或异种载体细胞能得到使用，那么可以在胶质母细胞瘤的起始治疗阶段使用上述载体细胞，这将使得这种治疗方法更为可行。本研究表明，由人BMSCtk细胞和GCV引发的旁观者效应能对抗多种人胶质瘤细胞，也能对抗鼠胶质瘤细胞。假如由免疫学反应引起的安全问题得到妥善解决的话，提前制备的BMSCtk细胞株能运用于以BMSC细胞为基础的HS⁃Vtk/GCV基因治疗中，而“BMSCtk疗法”将会成为更简单、可行的治疗恶性胶质瘤的一种新的治疗手段。

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