星形细胞肿瘤发生的分子生物学机制及与DEK mRNA表达的相关性研究

冯天达，刘云会，李超

（中国医科大学附属盛京医院神经外科，沈阳 110004）

DEK原癌基因最初是在（6；9）（p23；q34）染色体异位的急性髓性白血病（acute marrow leukemia，AML）亚型中所发现［1］，该异位导致位于6号染色体短臂上的DEK编码序列与位于9号染色体上编码核孔复合物的CAN基因片段融合，形成5′端是DEK序列，3′端是CAN序列的融合基因DEK⁃CAN。作为染色质结构的调节者，DEK参与多种依赖DNA和RNA的过程，既起激活作用也起抑制作用［2，3］。本研究应用RT⁃PCR技术检测星形细胞肿瘤组织及正常脑组织中DEK mRNA的表达水平，探讨DEK的表达与星形细胞肿瘤发生、发展的关系，为星形细胞肿瘤的早期基因诊断及治疗提供必要的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

收集2007年6月至2009年2月中国医科大学附属盛京医院神经外科手术切除并经病理证实的星形细胞肿瘤标本32例（星形细胞肿瘤组），及因颅脑外伤、脑出血行内减压手术获得的正常脑组织标本5例（对照组）。其中，男19例，女18例。所有病例均为初次治疗，术前未接受放疗、化疗。去除标本的出血、坏死及电凝灼烧组织后，立即浸泡于液氮并于-70℃冻存。按WHO神经系统肿瘤分类标准（2000年）将肿瘤标本分为低级别星形细胞肿瘤组（Ⅰ级毛细胞型星形细胞瘤和Ⅱ级弥漫性星形细胞瘤，n=14）和高级别星形细胞肿瘤组（Ⅲ级间变性星形细胞瘤和Ⅳ级胶质母细胞瘤，n=18）。

1.2 方法

用Trizol总RNA提取试剂提取标本总RNA，操作严格按照按说明书进行。用紫外可见分光光度仪检测RNA的纯度及浓度。

反转录反应：反应体系6.5 μL：RNA sample（1 μg/μL）1 μL，oligo（dT）20 primer（50 mmol/L）1 μL，RNase Free dH2O 4.5 μL。反应条件：65 ℃ 5 min，冰上迅速放置至少1 min，加入cDNA Synthesis Mix 3.5 μL［5×TB 2 mL，DTT（0.1 mmol/L）0.5 mL，RNase⁃inhibitor（20 U/mL）0.5 mL，SuperScriptTMⅢreverse transcriptase（200 U/mL）0.5 mL］，轻混瞬时高速离心，50 ℃ 60 min，70 ℃ 15 min，加入1 μL RNaseH 37℃ 20 min。

PCR：由GENBANK检索目的基因DEK序列，应用Primer 5.0设计引物，并经NCBI在线序列相似性分析工具BLAST检验。DEK、内参照β⁃actin引物于上海生物工程有限公司合成。DEK引物序列：上游5′AAGAATGTGGGTCAGTTCAG 3′，下游5′GTGCT GCTATCTGCTTTCTT3′，反应产物494 bp，退火温度56 ℃。β⁃actin引物序列：上游5′GTGGGCCGCTCTA GGCACCAA 3′；下游5′CTCTTTGATGTCACGCACG ATTTC 3′，反应产物700 bp，退火温度58℃。PCR反应体系（10 μL）：cDNA template 1 μL，2×PCR Buf⁃fer 5 μ L，dNTPs mixture（2 mmol/L）1 mL，Forward primer（10 mmol/L）0.5 mL，Reverse primer 0.5 mL，Sterilized ddH2O 1.9 mL，KOD FX（2.5 U/mL）0.1 mL。按以下条件进行PCR反应：94℃2 min，94℃15 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35个循环，72 ℃ 5 min。扩增产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，待溴酚蓝指示剂到达凝胶底部边缘时停止电泳，以溴化乙锭液（1 μg/μL）覆盖凝胶，染色5 min自动电泳凝胶成像分析系统观察拍照。检测吸光度值，将DEK基因目的片段条带与β⁃actin电泳条带的积分密度值（integrated density value，IDV）比值作为DEK mRNA相对含量。重复实验3次，取平均值行统计学分析。

2 结果

在20%（1/5）正常脑组织中检测到DEK mRNA极低水平表达，而在93.8%（30/32）的星形细胞肿瘤组织中DEK mRNA为阳性表达；DEK mRNA相对含量（DEK IDV/β⁃actin IDV）分别为：正常脑组织0.19±0.02，低级别星形细胞肿瘤组织（Ⅰ、Ⅱ级）0.71±0.07，高级别星形细胞肿瘤组织（Ⅲ、Ⅳ级）0.84±0.06。与正常脑组织相比，星形细胞肿瘤组织中DEK mRNA表达水平明显增高，差异具有统计学意义（P＆lt;0.05）；与低级别星形细胞肿瘤相比，高级别星形细胞肿瘤组织中DEK mRNA表达水平明显增高，差异具有统计学意义（P＆lt;0.05）（表1，图1）。

表1 DEK mRNA在正常脑组织和星形细胞肿瘤组织中的表达Tab.1 Expression of DEK mRNA in brain tissues and astrocytic tumour tissues

图1 RT⁃PCR法检测DEK mRNA的表达Fig.1 Expression of DEK mRNA by RT⁃PCR

3 讨论

人类肿瘤的发生、发展涉及多个癌基因、抑癌基因的突变导致的酶学、免疫学、生理生化改变和激素调节异常。星形细胞肿瘤的基因突变和有关调控途径比较复杂，可能涉及TP53/MDM2/p21通路、p16/p15/CDK4/CDK6/Rb通路及PTEN基因等。随着基因模型的建立、下游分子事件的描述等研究的深入，DEK通路的致癌机制越来越受到人们的重视。

DEK原癌基因的最初发现是以DEK⁃CAN融合基因的形式参与并促进AML的发生发展，并被认为是AML预后不良和再发的标志［4］。DEK既是一个原癌基因，也是自身抗原、趋化因子，参与转录调节、染色体结构和mRNA的形成、炎症的发生等，但其生物学功能目前尚未阐明。研究表明，DEK原癌基因在非小细胞肺癌、乳腺癌、慢性淋巴细胞白血病的发病机制上起一定作用［5～8］，并有可能成为新的治疗靶点。

本研究结果显示：在正常脑组织中DEK mRNA表达水平极低，阳性率为20%（1/5），相对含量0.19±0.02；而在星形细胞肿瘤组织中DEK mRNA阳性表达率为93.8%，其中低级别星形细胞肿瘤组织中相对含量0.71±0.07，高级别星形细胞肿瘤组织相对含量0.84±0.06。DEK mRNA在星形细胞肿瘤组织中表达水平明显增高，与正常脑组织相比，差异有统计学意义（P＆lt;0.05）。提示DEK的过表达与星形细胞肿瘤的发生关系密切，并对星形细胞肿瘤的早期形成起作用，主要作用于星形细胞恶变的早期。吕自力等［9］应用RT⁃PCR检测32例确诊为原发肝细胞肝癌组织及癌旁正常肝组织中相关基因表达情况，结果发现DEK mRNA在癌组织中阳性表达率为78.1%，癌旁正常肝组织中阳性表达率15.6%，有统计学差异（P＆lt;0.05），即使是AFP阴性的原发肝细胞肝癌也出现高表达。与本研究结果一致。因此推测DEK与肿瘤形成的初始阶段有关，可在早期实施干预。DEK的检测有可能成为星形细胞肿瘤早期基因诊断的指标。

本研究结果还显示：DEK的表达水平与星形细胞病理级别密切相关，DEK mRNA在高级别星形细胞肿瘤组织中表达水平明显增高，与低级别星形细胞肿瘤相比，有统计学差异（P＆lt;0.05）。既往的研究结果显示：DEK mRNA表达与肝细胞肝癌的组织学分级相关，在去分化的肝细胞肝癌中，DEK mRNA处于高水平状态［9］；DEK的表达程度越高，肝细胞肝癌的恶性化潜能越高。结合本研究结果，可以认为：DEK过表达不但与星形细胞肿瘤的发生关系密切，而且与肿瘤的发展也密切相关。DEK过表达可能是肿瘤由低恶性度向高恶性度演化的重要原因，同时也在一定意义上反映了星形细胞肿瘤的恶性潜能。

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［4］Deguchi K，Gilliland DG.Cooperativity between mutations in tyro⁃sine kinases and in hematopoietic transcription factors in AML［J］.Leukemia，2002，16（4）：740-744.

［5］Alexiadis V，Waldmann T，Andersen J，et al.The protein encoded by the proto⁃oncogene DEK changes the topology of chromatin and reduces the efficiency of DNA replication in a chromatin⁃specific manner［J］.Genes Dev，2000，14（11）：1308-1312.

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［8］Wang DM，Liu L，Fan L，et al.Expression level of DEK in chronic lymphocytic leukemia is regulated by fludarabine and Nutlin⁃3 de⁃pending on p53 status［J］.Cancer Biol Ther，2012，13 （14）：1522-1528.

［9］吕自力，文剑明，罗殿中，等.肿瘤相关基因在肝细胞癌及癌旁正常肝组织中表达［J］.临床与实验病理学杂志，2004，20（6）：654-657.