维康醇对肝癌细胞增殖抑制和诱导凋亡的作用

王艳丽，朱晓琳，段丽丽，陈杰鹏，牛哲峰，曲迎春，丛培芳，李岭，张美侠

（1.中国医科大学药学院临床药理教研室，沈阳 110001；2.广东汕头保税区双骏生物科技有限公司应用生物技术研究所，广东 汕头515071；3.四川大学生命科学学院遗传医学研究所，成都 610041）

肝细胞性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一，其发病率居全球恶性肿瘤的第6位，死亡率居第3位［1］，5年生存率＆lt;5%［2］。肝癌的治疗手段不断丰富，但目前其治疗仍然以手术治疗为主，配合以放疗、化疗、生物治疗等多种治疗手段。到目前为止，肝癌的化疗效果还不尽如人意。紫杉烷类的代表药物紫杉醇（pacli⁃taxel，PTX）是从紫杉树树皮中提取的一种天然植物类抗肿瘤药物，是乳腺癌、卵巢癌及非小细胞肺癌的一线和二线治疗药物，并可用于治疗头颈癌、食管癌、精原细胞瘤和复发性非霍奇金淋巴瘤等［3～7］。维康醇是在PTX菌种发酵过程中获得的产量较大的一种新型单体化合物。研究证实，维康醇对前列腺癌、胃癌、白血病等恶性肿瘤有抑制作用［8～10］。本研究组前期研究结果证实其对胰腺癌、卵巢癌等肿瘤细胞株也具有增殖抑制作用，并具有引起细胞周期阻滞和诱导细胞凋亡的作用，但它对肝癌细胞的作用未见报道。本研究拟应用MTT法、流式细胞术等方法，研究维康醇对肝癌细胞增殖抑制、细胞周期阻滞及细胞凋亡的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

RPMI⁃1640培养液（GIBCO公司，美国），胎牛血清（天津灏洋生物公司，中国），MTT（methylthiazolyl tetrazolium）、碘化丙锭（propidium lodide，PI）（Amres⁃co公司，美国），Annexin V⁃FITC试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司，中国）。人肝癌细胞系HepG2由中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所提供。维康醇由广东省汕头市双骏生物工程有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 MTT法检测细胞增殖：取对数生长期的HepG2细胞制成细胞悬液（5×104/mL），接种于96孔板中（100 μL/孔）。培养24 h后加入以含10%FBS的RPMI⁃1640培养液稀释的药物，终浓度分别为3、10、30 μmol/L，每个浓度设3个复孔，同时包括实验组、溶剂对照组、空白对照组，药物作用24、48、72 h后，加入MTT（5 mg/L），每孔10 μL，37 ℃孵育4 h，加入 100 μL 10%SDS（含 10 mmol/L HCl）以终止反应，37℃过夜后使用酶标仪检测570 nm波长处的吸光度值（OD值）。实验重复3次。计算细胞增殖抑制率=（1-实验组OD值/对照组OD值）×100%。

1.2.2 流式细胞术检测细胞周期：HepG2细胞接种至6孔板内（1×106/孔），贴壁过夜，次日加入维康醇，浓度分别为3、10、30 μmol/L，同时设溶剂对照组。药物作用48 h后，0.25%胰酶消化收集细胞，预冷的70%乙醇4℃固定细胞过夜。用100 mg/mL PI（含50 μg/mL RNA酶）溶液重悬细胞，室温下避光染色15 min后，用流式细胞仪进行细胞周期检测。

1.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡率：HepG2细胞接种于6孔板中（1×106/孔）过夜，分别用3、10、30 μmol/L维康醇及溶剂处理，48 h后收集细胞，预冷PBS离心洗涤2～3次。将细胞重悬于250 μL结合缓冲液中，加入10 μL Annnexin V⁃FITC和5 μL PI，轻轻混匀，室温避光反应30 min后，用流式细胞仪分析细胞凋亡率。

1.3 统计学分析

采用SPSS 16.0统计软件处理，对数据进行单因素方差分析、LSD⁃t检验，以双侧P＆lt;0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 维康醇对HepG2细胞的增殖抑制作用

MTT实验结果显示：不同浓度（3、10、30 μmol/L）及作用时间（24、48、72 h）条件下，维康醇均对HepG2细胞的增殖具有抑制作用，且随着药物浓度的升高及作用时间的延长抑制率也相应增加，与对照组相比差异有统计学意义（P＆lt;0.05）。说明维康醇对HepG2细胞具有明显增殖抑制作用，并呈时间和剂量依赖性。见图1。

图1 维康醇对HepG2细胞的增殖抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of alternol on the proliferation of HepG2 cells

2.2 流式细胞仪检测维康醇对HepG2细胞周期的影响

流式细胞仪检测结果显示：30 μmol/L维康醇作用于HepG2细胞48 h后，处于G2/M期的细胞比例明显升高［30 μmol/L维康醇处理组的G2/M期的细胞为（16.39±0.5）%，对照组的G2/M期的细胞为（9.4±1.59）%］，同时伴随G1/G0期的细胞比例下降［30 μmol/L维康醇处理组为（60.23±2.1）%，对照组为（76.92±8.39）%］，差异有统计学意义（P＆lt;0.01）。见图2。

2.3 流式细胞仪分析维康醇对HepG2细胞凋亡的诱导作用

Annexin V⁃FITC/PI染色检测结果显示：维康醇可以引起HepG2细胞凋亡，30 μmol/L维康醇作用于HepG2细胞48 h后的细胞凋亡率为（31.5±5.78）%，溶剂对照组为（6.98±2.43）%。见图3。

3 讨论

HCC的发病率占所有肿瘤疾病的5%，全世界每年约600 000人死于肝癌［2］。目前HCC仍以手术治疗为主，但治疗率低、复发性高、预后差。化学药物治疗是治疗肝癌尤其是无手术指征的晚期肝癌的重要方法，但常因耐药和复发导致肝癌化疗失败［11］。由于肝癌的不良预后，研究开发新的有效的抗肝癌新药仍然是未来的研究热点。

图2 维康醇对HepG2细胞周期的影响Fig.2 Effect of alternol on cell⁃cycle distribution of HepG2 cells

图3 维康醇对HepG2细胞凋亡的影响Fig.3 Effects of alternol on HepG2 cells apoptosis

恶性肿瘤的无限增殖特性与细胞增殖周期的失控有关［12］。正常的细胞周期由G1⁃S⁃G2⁃M组成，其间存在G1/S和G2/M 2个重要调控点，其调控功能的丧失导致肿瘤的发生。多数化疗药物均可引起细胞周期阻滞，达到抗肿瘤的作用。本研究结果显示：维康醇引起肝癌HepG2细胞在G2/M期比例明显增加，并伴随G1/G0期的细胞比例下降，证实维康醇对肝癌HepG2细胞存在细胞周期阻滞现象。

研究证实，细胞周期与细胞凋亡既相互联系，又相互独立。细胞凋亡是指真核细胞为维持内环境稳定，由基因调控的细胞自主性有序性的死亡，它涉及一系列基因的激活、表达以及信号转导途径。细胞凋亡的发生通常是细胞先阻滞在细胞周期的某一时相，继而在此期发生细胞凋亡，从而表明肿瘤的发生发展不仅是由于细胞增殖的失控，也与细胞凋亡受阻相关。因此抑制肿瘤细胞的增殖和诱导肿瘤细胞发生凋亡是大多数化疗药物抗肿瘤的主要作用机制［13～15］。本研究结果证实30 μmol/L维康醇作用于HepG2细胞可诱导其发生凋亡。

综上所述，维康醇对肝癌HepG2细胞的增殖具有明显抑制作用，且呈浓度、时间依赖性。维康醇作用于HepG2细胞后，引起G2/M期细胞周期阻滞，同时诱导细胞的凋亡。维康醇通过引起细胞周期阻滞和诱导细胞凋亡抑制了肝癌HepG2细胞的增殖，从而达到抗肝癌作用。但其具体的分子机制有待进一步研究。

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