双重修饰的主动靶向脂质体研究进展

2014-03-06 11:47田吉来丁晨静
药学研究 2014年8期
关键词:靶细胞脂质体双重

蒋 雯,田吉来,丁晨静,鞠 安,顾 宁

(东南大学生物科学与医学工程学院,江苏南京211189)

·综 述·

双重修饰的主动靶向脂质体研究进展

蒋 雯,田吉来,丁晨静,鞠 安,顾 宁

(东南大学生物科学与医学工程学院,江苏南京211189)

主动靶向脂质体是靶向递药体系的一个重要角色。由于传统的单一基团修饰的主动靶向脂质体存在靶向效率不高、细胞摄取率不高等缺点,人们不断探索采用两种或多种不同识别分子或其他协同分子共同修饰脂质体。本文拟针对双重修饰脂质体技术的研究进展进行综述。通过对两种特异性配体或抗体共同修饰、特异性配体与细胞穿透肽共同修饰、两种细胞穿透肽共同修饰等不同类型的双重修饰脂质体的综述分析,我们发现双重修饰技术具有提高靶向准确性和靶向效率,提高药物摄取,提高对靶点的黏附能力和血流稳定性等优势,尤其在跨膜穿越屏障系统的应用中凸显作用。

脂质体;双重修饰;主动靶向

脂质体(liposome)是指由磷脂分子分散在水中形成的一个具有双分子层结构的包封一部分水相的类球状微型囊泡。脂质体以磷脂为膜材,具有很好的生物相容性,是一种具有广阔应用前景的载药体系。但需要注意的是,由于脂质体在体内循环过程中容易被网状内皮系统(reticuloendothelial system,RES)识别为外来物质并吞噬,常常难以达到理想效果。为克服这种障碍,须在脂质体表面添加一层亲水的惰性聚合物(如聚乙二醇[1]、泊洛沙姆[2]、壳聚糖[3]等),以减少血浆蛋白和脂质体的调理作用,阻止脂质体的凝集和聚合,避免网状内皮系统的吞噬,延长脂质体在体内的循环时间,达到长循环的效果,如目前效果较好且已经实现市场化的聚乙二醇(PEG)化长循环脂质体[4]。

为了实现脂质体更高的靶向效率,通常会在其表面修饰识别基团和特定的靶细胞相作用,从而促进脂质体或者药物内化,达到“主动靶向”的效果。常用的修饰基团有单克隆抗体(mAb)、多肽、糖蛋白、维生素、碳水化合物等。利用靶细胞特异性表达某些物质,将识别该物质的配体修饰在脂质体表面,就可以达到靶向定位的效果,将载药脂质体带到特定的部位,从而使释放的药物更具针对性。这是常见的主动靶向脂质体原理[5]。然而常常事与愿违,常用配体的受体都不只在一种细胞上表达,这也就意味着在脂质体长循环过程中,不仅会在靶细胞处积累,也有可能在其他非靶细胞处(off-target cells)积累并造成伤害。单靶头修饰的主动靶向载体也存在一些问题,如受体下调造成靶向效率下降[6]。为了提高靶向效率,人们又对原先的单一基团修饰的脂质体进行了改进,采用两种不同类型的基团修饰主动靶向的脂质体。本文就近些年来双重修饰脂质体的进展进行综述。

1 双重修饰的主动靶向脂质体类型

1.1 两种特异性配体(specific ligand)修饰脂质体 根据靶细胞通常不只特异性表达一种物质,则可以从概率学角度进行筛选,利用多种特异性配体识别定位靶细胞,以减少对非靶细胞的识别。目前尝试的多是用两种特异性配体进行修饰[7,8]。

Laginha等[9]采用Alexa Fluor350和532荧光团标记单克隆抗体(mAb),利用荧光测定法定量确定脂质体表面抗体密度。根据B淋巴瘤细胞过度表达CD19和CD20,研究分4实验组进行:表面具有相同单抗密度的仅anti-CD19-mAb修饰的脂质体,仅anti-CD20-mAb修饰的脂质体,anti-CD19-mAb和anti-CD20-mAb共同修饰的脂质体,以及anti-CD19-mAb修饰和anti-CD20-mAb修饰按照1∶1组成的脂质体混合物。体外结果表明:后两组的细胞结合和摄取量相似,均比前两组仅用一种抗体修饰的脂质体的多。细胞毒性实验则表明,包封有阿霉素(DXR)的第三组双重修饰脂质体比第四组混合脂质体的细胞毒性更高。综合结果说明双重修饰的脂质体能实现最佳的药效。

Saul等[10]利用KB细胞过度表达叶酸受体(folate receptor,FR)和表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR)以及利用叶酸和anti-EGFR-mAb(mAb225)同时修饰脂质体,并包封阿霉素(DXR)以根据细胞毒性确定脂质体的靶向选择性。为了模拟体内环境中存在的非靶细胞,将细胞表面的相应的受体饱和而失去作用,实验事先利用过量叶酸、过量mAb225和两种混合物分别培养出3组KB细胞,并连同正常的KB细胞组,分别和双重修饰脂质体共同培养。实验表明双重修饰的脂质体只能靶向两种受体都开放的靶细胞(正常KB细胞组),这就有力地证明了双重修饰的脂质体具有极高的靶向选择性,实现的是靶向受体“交集”的效果,而非“并集”,也就降低了对其他非靶向细胞的作用。

但是上述实验均在体外细胞实验中获得,通常排除了脂质体在体内循环中遇到的调理作用等复杂情况,并忽略了体内其他未知的非靶细胞对于脂质体靶向的影响,而更多地只是关注靶细胞处的作用机理。所以后续又开展了很多体内实验,并且进一步验证了体外实验的结论。

Ying等[11]利用甘露醇和转铁蛋白同时修饰脂质体,在体外血脑屏障(blood brain barrier,BBB)模型和动物体内实验中都实现了相比单一修饰脂质体更好的细胞摄取率、靶向能力、抑制癌细胞增殖作用和抑制肿瘤生长作用,同时还成功地穿越了血脑屏障。该实验既展现了用以修饰脂质体的配体的更多可能,又在体内水平证明了两种特异性配体修饰脂质体的优越性。

Murase等[12]在探究抗新生血管疗法时(antineovascular therapy,ANET),通过PRD和NGR这两种特异性结合的配体分别修饰和共同修饰的脂质体在体外和体内的对比试验发现,这三种脂质体均比未加修饰的长循环脂质体靶向新生血管效果更好,而双重修饰的脂质体又比单一修饰的脂质体结合量更高,定位效果更好。相比于NGR单一修饰的脂质体容易在脾脏中积累,双重修饰的脂质体更易于在血流中循环运行,从而进行对新生血管的靶向。所以双重修饰的脂质体对HUVEC的生长和增殖的抑制效果最佳,抗肿瘤效果最好。

以上的配体连在PEG长链上再连结在脂质体上,是一种靶向和长循环加和的作用,两种配体或抗体,相当于脂质体同时伸出的两只爪子,将靶细胞抓得更牢固,抓的对象也更富选择性,实现了脂质体载药的高效性和准确性。

对特异性靶细胞受体的选择通常考虑的因素有:受体在靶点处的过度表达程度或特异性表达程度;促进细胞内化的能力;脱落的可能性等[6]。而对双重修饰的脂质体,除了以上考虑之外,还应该考虑不同受体和不同修饰配体之间的相互作用。比如,当两种靶细胞受体通过相同的内吞途径时,靶细胞对脂质体的联结和摄取能力应当是协同增强的;而当两种靶细胞受体介导的是不同的细胞摄取途径时,靶细胞对脂质体的摄取能力则可能是加和作用或者拮抗作用。又如,两种配体同时修饰靶向同一种细胞表面受体时,就会存在竞争关系,并且由于细胞表面受体密度未变,其结合存在饱和性,使得双重修饰并不能提高靶向效率。再如,两种受体在生物体内分布的交叉性,是否足以更准确地指向目标细胞。还有靶细胞表面两种受体的空间关系,是否会因为距离过近而存在空间位阻导致结合脂质体的困难,或者导致脂质体的共价结合(即一个脂质体结合两个或多个受体)从而减少脂质体的摄入量。这些考虑都让双重修饰脂质体的靶向受体和修饰配体的选择变得更加复杂和值得推敲。

1.2 特异性配体和细胞穿透肽(CPP)修饰脂质体 细胞穿透肽(cell penetrating peptide,CPP),也称为蛋白转导域(protein transduction domain,PTD),是带有正电荷的肽段,通常少于30个氨基酸,能在不对细胞造成伤害的情况下携带大分子进入细胞,所以常运用在靶向载药体系中。而且由于CPP带正电荷,所以能够通过静电相互作用而与细胞结合,但不具备特异性,不属于特异性配体[13,14]。

Sharma等[15]将转铁蛋白和一种PR的CPP分别修饰在PEG链的末端,再连接到脂质体表面,包裹质粒DNA,结果显示了其较未经修饰的长循环脂质体和仅用转铁蛋白修饰的长循环脂质体具有更高的穿越血脑屏障的效率和DNA转染率,可见细胞穿透肽发挥了重要的作用。Tanga等[16]类似地运用转铁蛋白和TAT的CPP分别修饰在PEG链的末端,在连接到脂质体上,同时提高了靶向准确性和细胞摄取量。

由于CPP携带正电荷,其非特异性作用使其更容易在体内循环过程中被吞噬,不利于长循环的效果,同时阳离子聚合物也会与阴离子表面的细胞膜作用造成红细胞裂解和血红蛋白的释放,所以更理想的是CPP可以被连有特异性配体的亲水长链掩蔽隐藏。上述实验中Sharma定量控制了CPP的用量,且转铁蛋白和PEG的负电荷已经超过了CPP的中和量,所以不会造成溶血现象。而Tang的实验中则额外控制了PEG的不同长度,使CPP同样能够被更长链的PEG隐藏。

Takara等[17]将一种STR-R4的CPP包裹在脂质体表面,再连上末端有NGR修饰肽的PEG链,NGR能够识别肿瘤细胞过度表达的CD13。该脂质体在多种肿瘤细胞的体内外实验中都展现了很优越的靶向作用和细胞摄取。Kibra等[18]也类似地将STR-R8这种CPP修饰在了RGD-PEG-Liposome的表面,CPP的引入使得原来单一靶向的脂质体的细胞膜穴样内陷胞吞途径,向网格蛋白介导的胞吞途径转变,并增加了细胞摄取量和准确性。而Jiang等[19]将一种人工改造合成的R6H4的CPP包被在脂质体表面,再连结上透明质酸(HA),构成双重修饰的脂质体。HA一方面具有和PEG类似的功能,中性条件下带负电荷,有亲水性,可以实现脂质体的长循环;另一方面一些恶性肿瘤细胞表面有HA的受体如CD44和RAHMM,可以实现靶向;再者,肿瘤的微酸性环境中广泛分布着透明质酸酶,可以帮助水解去除HA的包裹从而暴露CPP。Jiang的实验也表明了这种双重修饰方式具有协同作用,提高了脂质体的细胞摄取量和药效。实验中的CPP要保证能够被PEG或HA亲水层盾护,所以在设计选择时对大小有一定要求,方便亲水层的空间位阻发挥作用。此外,Jiang的实验还着重研究了人工合成的CPP在不同pH下的作用,发现该脂质体能在pH=6.4的条件下比pH=7.4发挥出更好的药效,这也符合肿瘤微环境微酸性的特性。

另外,还由于CPP的正电荷而更利于外源DNA的转染[15]。CPP可以利用蛋白质工程的手段,根据需求反向设计其结构和氨基酸序列,人工合成筛选达到更加理想的效果。

在这一类型的双重修饰主动靶向脂质体中,特异性配体首先实现对细胞的靶向,而CPP则进一步帮助细胞摄取药物,达到协同效果,药效更显著。其优势主要表现在以下几个方面:其一,特异性配体与靶细胞表面的受体结合具有饱和性,而CPP的静电作用不存在饱和性;其二,CPP具有正电荷,已经有研究表明带阳离子的脂质体比中性脂质体在肿瘤区域积累更多、更深、更久[20];再者,CPP帮助跨越细胞膜,使得脂质体能够在胞内释放药物。

特异性配体和CPP双重修饰的脂质体是层层递进发挥效用的,与加和作用不同。加和作用往往会因为两种配体同时靶向,造成细胞表面黏附的脂质体拥挤的状况,而协同作用不存在这种问题。但CPP修饰的脂质体虽跨越细胞膜能力增强,但是由于其非特异性结合,所以并未带来靶向准确性的大幅度提高,而这一点在两种特异性配体修饰的脂质体中是可以实现的。上面Sharma的实验中,脂质体穿越血脑屏障的能力增强、在脑部积累量增加的同时,在其他身体器官内的积累也相应增强,如脾脏、心脏、肺等,这就会使包封的质粒DNA在非靶细胞处也能转染、表达和发挥作用,可能会带来未知的副作用。归结起来,CPP的修饰会“盲目”地增强脂质体的药效,而特异性配体能够为其指明方向。

1.3 两种细胞穿透肽(CPP)修饰脂质体 KYND作为一种较新的CPP,通过网格蛋白介导的内吞作用帮助细胞摄取大分子。而同时KYND又是一种肿瘤表皮标记物(tumor endothelialmarker 8,TEM 8)的配体,具有一定的主动靶向效果。所以Kibria等[21]利用R8的CPP包被脂质体后,连上有KYND末端的PEG长链,制成的双重修饰脂质体比用单个CPP修饰的脂质体具有更好的摄取率和准确度,所以也被视为有前景的载药体系。

其实该种脂质体和上一类型的脂质体作用类似,都是靶向和细胞穿透的协同作用,不同的是第一层靶向的同时就兼具了细胞穿透的效果。而这一实验再次向我们展示了CPP多样的功能,带给我们更多期待和想象力。

2 双重修饰的主动靶向脂质体的尺寸研究

在采用化学药物治疗癌症肿瘤时,肿瘤细胞(tumor cell,TC)往往容易产生抗药性。而肿瘤表面的新生血管内皮细胞(tumor endothelial cell,TEC)则对药物更敏感,所以设计载药体系针对TEC发挥药效会达到更好的抗癌效果[22]。而由于实体瘤的高通透性和滞留效应(EPR effect)[23],所以尺寸较小的脂质体会被动靶向到肿瘤细胞,但这对于具有高抗药性的肿瘤细胞起不到好的药效。Takara等[24]尝试利用大尺寸的脂质体靶向TEC,而不受EPR效应的影响靶向TC。实验选择了具有极强抗药性的肾癌(renal cancer carcinoma,RCC),并通过对载瘤小鼠进行尾静脉注射脂质体进行研究。实验先对比了100 nm和300 nm的PEG化脂质体分布情况,发现100 nm的脂质体因EPR效应在肿瘤区分布更多,但距离血管较深,而300 nm的则分布量少,但主要分布在了血管附近。又对300 nm的脂质体,分成仅用PEG修饰、NGR(可以特异性靶向到RCC的TEC上的CD13)连结PEG修饰、R4的CPP修饰和NGR/CPP双修饰四组的体内分布情况对比,结果显示前三者在肿瘤血管区分布均较少,而双重修饰的则大量分布。经过包封抗癌药物DXR后,大尺寸的双重修饰的脂质体比两种单修饰的脂质体抑癌作用大大提高。最后实验将包封有DXR的300 nm的双重修饰的脂质体和100 nm的普通脂质体(一种常用脂质体类药物,Doxil)对比得出前者更加优越的抑制肿瘤生长的作用。实验层层递进向我们展示了双重修饰在大尺寸脂质体这个平台上的重要应用。类比我们联想到双重修饰的脂质体将会更能抵抗流体的剪切力作用进行靶向结合,配合大尺寸的更大吸附面积发挥作用。如果没有双重修饰,大尺寸的脂质体即使有更大的表面吸附面积,也较难抵抗血流冲击而靶向吸附在血管内皮细胞,进而将其破坏裂解发挥抗癌作用。同时,看似“离经叛道”的大尺寸脂质体,不符合EPR效应的要求,但可以另辟蹊径解决肿瘤抗药性的问题,靶向结合到对药物更加敏感的新生血管发挥作用,是双重修饰的重要应用方向。可见,大尺寸脂质体搭配上双重修饰才能发挥出更理想的效果。

3 双重修饰的主动靶向脂质体的膜流动性研究

由于修饰的配体连结在脂质体的流动膜表面从而与靶细胞作用,所以不难推测,对于双重修饰的脂质体,脂质体膜的流动性对于两种不同的配体如何与细胞膜接触、相互作用以及两种配体之间的关系有着重要意义。Gunawan等[25]用两种抗体anti-ICAM和anti-ELAM同时修饰脂质体,而脂质体的膜则用DOPC和DPPC这两种有着不同物理性质的磷脂分别制成进行对比实验。在37℃的条件下,DOPC呈液态,DPPC呈凝胶态,两者具有不同的流动性。而实验结果也显示了DOPC脂质体与靶细胞联结得更好,说明膜流动性越大,双靶向脂质体靶向越紧密。尽管靶向过程中脂质体膜表面的两种抗体究竟是如何分布、如何作用仍旧不明朗,但这也带给我们新的启迪,不仅仅要将目光放在修饰的配体上,也要关注脂质体本身的性状,其膜流动性、膜的结构特征、连接配体的方式等众多微观上的性质都可能会对脂质体效用的发挥产生影响,而目前的研究还十分有限。

4 双修饰的靶向脂质体在穿屏障系统中的应用

双重修饰的主动靶向脂质体的一个重大应用就在于穿越血脑屏障(blood brain barrier,BBB)。血脑屏障是指脑毛细血管壁与神经胶质细胞形成的血浆与脑细胞之间的屏障和由脉络丛形成的血浆和脑脊液之间的屏障,这些屏障能够阻止某些物质(多半是有害的)由血液进入脑组织,但这也给载药体系进入脑部带来困难。但是BBB也有载体转运系统,用以脑组织和外界进行物质交换,这就是修饰脂质体的特异性配体发挥作用的依据[26]。如转铁蛋白(transferrin,Tf)既可以通过转铁蛋白受体高效穿过BBB,又可以靶向过度表达的肿瘤细胞;MAN甘露糖既可以通过BBB上的糖类转运蛋白GLUT穿过,也可以靶向过度表达的肿瘤细胞;CPP可以帮助穿过细胞从而跨越BBB,又可以通过静电作用对肿瘤细胞产生危害。这些配体相互配合可以起到加和或协同作用实现更好的药效。

Gao等[27]利用Tf和叶酸(folate,F)共同修饰脂质体,Tf可以对抗ABC运输蛋白(ATP-Binding-Cassette transporter)的作用,减少对药物的外泵,并且帮助通过BBB,进入脑组织后,叶酸则靶向到胶质瘤细胞上,包封的DOX发挥药效。该脂质体比单一修饰的脂质体展现了更好的穿越屏障系统的能力,并且减少了药物在心脏的积累降低了毒副作用。Ying等[11]利用Tf和MAN共同修饰,同样获得了优越的穿越BBB和靶向神经胶质瘤细胞的双重的效果。穿越BBB时,MAN起主导作用,Tf辅助;靶向目标细胞时,Tf起主导作用,MAN辅助,两种配体一直相互配合发挥作用。Sharma等[15]利用Tf和PR这种CPP共同修饰脂质体,较之单一修饰的脂质体在脑组织区获得了更高的积累量。众多实验都证明了双重修饰的脂质体是极具价值的脑部载药体系。一般的单一修饰脂质体在面对血脑屏障这种复杂的系统时往往显得力量单薄,而此时双重修饰的脂质体的加和作用或协同作用就体现出了穿越屏障系统的价值,同时能够实现穿越后的靶向给药作用。

5 总结与展望

双重修饰的递送载体具有提高靶向准确性[28],提高靶向效率,提高药物摄取,提高对靶点的黏附能力和血流稳定性[24],跨膜穿越组织屏障等优势作用,引起人们广泛关注。双重修饰的主动靶向脂质体在修饰配体的选择和搭配上更具多样性,能够发挥加和或协同作用。

采用两种特异性配体修饰的脂质体能够利用受体分布的交叉特性更准确地筛选出靶向细胞,但在细胞摄取上优势不明显。而采用特异性配体和CPP这种非特异性配体搭配修饰的脂质体的优势更多体现在穿透进入细胞,却在靶向性上难有显著提高。当然,CPP自身广泛多样的性质又提供了更多的可能,所以也会有像KYND这种具有靶向性的CPP出现。而且由于CPP作为小分子肽,未来随着蛋白质工程的发展,我们就可以更多地依据我们的需求人为设计出兼具多种功能的CPP,以作为配体修饰脂质体。

此外,除了关注修饰配体本身之外,对于脂质体亲水护盾材料的选择也会在PEG之外有更多可能。如透明质酸(HA)就具有亲水性的同时又具有靶向性,并且很容易水解,是一种理想的长循环保护材料。再如泊洛沙姆,其除了本身的亲水-疏水-亲水三嵌段结构之外,还具有一定的对抗多样耐药性的作用[29],所以也是一种可以发展的多功能的亲水护盾。而且未来会有更多的人工合成的多功能聚合物出现,提供更优质的修饰配体连结材料和脂质体长循环亲水护盾。

我们期待今后双重修饰的主动靶向脂质体发展分为宏观和微观两个方向。宏观上,脂质体在体内长循环过程的控制。一方面,配体连结在亲水大分子末端再插入脂质体,这在一定程度上降低了亲水大分子的保护作用,所以需要更好地把握修饰配体的量来实现亲水护盾和靶向结合之间的平衡。另一方面,脂质体在长循环过程中在非靶细胞处的积累可能会带来一定的副作用,如穿越血脑屏障的困难使得脂质体在外周器官中有着大量的积累,所以需要更精准地控制其集中到目标区域。微观上,对于脂质体和靶细胞结合时的具体细节的掌握将能够帮助我们设计出更加理想的载药体系。如靶向结合时脂质体和细胞膜的流动性影响,修饰配体之间和配体受体之间的相互作用,靶向结合在生物环境下如血流条件下对力的对抗,靶向结合的稳定性,脂质体亲水层对于药物释放的影响等等,都值得进一步研究。如在低速条件下,双重修饰的微型囊泡和单一修饰的微型囊泡黏附能力没有太大区别,而在高速条件下,双重修饰的囊泡尽管也有减少,但明显比单一修饰的囊泡的结合能力要好[24]。又如Chytil等[30]探究纳米颗粒(nano particles,NP)中药物聚合物隔层对于药物释放速度的影响,以及不同的药物释放速度达到的不同疗效,这对脂质体研究同样具有一定的指导价值。

未来的脂质体药物将会更多地向病人导向发展,进行个体化设计。在Yu等[31]的研究中,就针对个体病人的细胞采用抗体微阵列技术,选择出恰当的抗体对脂质体进行双重修饰,实现了很好的靶向性收和很好的疗效。所以,脂质体载药体系的发展将会与众多其他生物技术相结合,如基因工程、蛋白质工程等,实现更个性化、人性化的医疗体验。

我们期待着未来更多的修饰配体的发现和应用,期待着这些配体以更加巧妙的搭配组合和共同作用不会引起在血流中的清除,增加血流中的稳定性,可以很好的接近靶点,可以精准靶向和内化等,也期待更深入的生物技术的发展,这些都将帮助我们建立更加新颖的靶向载药体系。

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Research progress on dually modified active targeting liposomes

JIANGWen,TIAN Ji-lai,DING Chen-jing,JU An,GU Ning
(School of Biological Science and Biomedical engineer,Southeast University,Nanjing 211189,China)

Active targeting liposomes play important roles in targeted drug delivery system.However,conventional singly modified active targeting liposomes have some disadvantages,such as unsatisfied targeting efficiency and low cellular uptake.Researchers are exploring liposomesmodified with different two ormore kinds of targetingmolecules and other synergistic molecules.This article reviewed the research progress of dually modified targeted liposomes,which were divided into three groups:dual ligandsmodified liposomes,specific ligand and cell penetrating peptide co-modified liposomes,and dual cell penetrating peptidesmodified liposomes.According to the analysis,we concluded that duallymodified liposomal therapeutics had superiority in targeting specificity,targeting efficiency,drug uptake,cohesion to the target,stability in blood flow,and distinguishing effects in crossing barrier systems.

Liposomes;Duallymodification;Active targeting

R944

A

2095-5375(2014)08-0469-006

国家重大科技专项重大项目(No.2011CB933500)、国家自然科学基金(No.81302730)、东南大学大学生创新实践项目(No.T14112002)

蒋雯,女,研究方向:生物医学工程,E-mail:vivianchiang@126.com

顾宁,男,教授,博士生导师,研究方向:纳米材料及其在生物医(药)学中的应用,Tel:025-83272476,E-mail:guning@seu.edu.cn

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