姜黄素对人宫颈癌Hela细胞增殖的抑制作用

陈昌明，刘慧芳，曹雪姣，李新莉，辛毅，张翠丽（大连医科大学生物技术系，辽宁 大连 116044）

姜黄素（Curcumin）是从姜科姜黄属植物姜黄（Curcuma longa）根茎中提取的一种酚性色素，具有抗炎、抗氧化、降脂、抗病毒、清除自由基的作用[1-2]，同时还可抑制小鼠肉瘤S180、人大肠癌细胞HT29、肾癌细胞293、肝癌细胞HepG2细胞生长[3-5]。有文献报道，姜黄素可抑制酪氨酸蛋白激酶（PTK）活性，从而抑制肿瘤细胞增殖，并通过阻断细胞信号传导途径促发细胞凋亡[6]。本研究通过姜黄素对人宫颈癌Hela细胞的增殖抑制、促凋亡和细胞周期各时相的变化以及抑癌基因p53蛋白的表达影响的研究，为姜黄素的抗癌研究和应用提供实验依据。

1 材料

1.1 仪器

E100型倒置相差显微镜[尼康仪器（上海）有限公司]；CO2孵箱、MK3型酶标仪（美国Thermo公司）；FC500型流式细胞仪（美国Beckman公司）。

1.2 药材

姜黄于2012年4月购于大连中药店，经大连医科大学生物技术系李新莉讲师鉴定为真品。

1.3 药品与试剂

姜黄素对照品（天津一方科技有限公司，批号:20121259，纯度:≥98%）；MTT（美国Amresco公司）；抗体β-actin、p53、HRP辣根过氧化物酶（武汉博士德生物工程有限公司）。

1.4 细胞

人宫颈癌Hela细胞株由大连医科大学生物技术系实验室提供。

2 方法

2.1 姜黄素的提取

姜黄置50Ⅸ恒温干燥箱过夜，粉碎过200目筛网。姜黄粉末按1∶10（m/V）加入70%乙醇浸提48h，抽滤浸提液，旋蒸，等分提取物分别以酸碱法和萃取法提纯，计算得率[7]。姜黄提取液置－20Ⅸ贮藏，备用。

2.2 姜黄提取液质量浓度的测定

准确称取20mg姜黄素对照品，加入200μl甲醇溶解得姜黄素对照品溶液（100mg/ml）。定量移取姜黄素对照品溶液（100mg/ml）适量，甲醇逐级10倍稀释至0.1mg/ml；分别取0.1mg/ml的姜黄素对照品溶液10、20、30、40、50、60μl与姜黄提取液30μl（甲醇溶解，质量浓度为0.1mg/ml），均设3复孔，以甲醇定容至200μl量瓶中，检测420nm波长处的光密度（OD）[8]。分别以姜黄素浓度（c）为横坐标，OD为纵坐标，进行线性回归，计算姜黄提取液的质量浓度。

2.3 细胞增殖抑制实验[6]

取1.0×105ml－1的对数生长期Hela细胞，接种于96孔板（200μl/孔）。至细胞贴壁，每孔加入200μl姜黄提取液（以0.05mg/ml为单位添加，自0.05mg/ml至0.50mg/ml计10个质量浓度，各质量浓度设3个平行孔）；以同体积1640培养液为空白对照；以只加姜黄提取液的甲醇溶液为阴性对照（200μl/孔，3复孔）。酶标仪检测589nm波长处的OD，计算细胞增殖抑制率。抑制率＝（空白对照组OD－用药组OD）/空白对照组OD×100%。

2.4 形态学观察

取对数生长期的Hela细胞，加入终质量浓度为0.02、0.06、0.10mg/ml的姜素提取液3ml，培养24h，以倒置显微镜观察Hela细胞形态学变化。

2.5 Hela细胞总蛋白含量的测定[7-8]

取分别加入0.05、0.25mg/ml的姜黄提取液（药物组）以及常规1640培养液（空白对照）培养24h的Hela细胞，以0.25%胰蛋白酶消化，4Ⅸ下，以离心半径为8 cm、4000 r/min离心6min，加1ml PBS（pH7.2）沉淀，移入1.5ml离心管中，再次离心弃上清。向离心管中加入200μl细胞裂解液[苯甲基磺酰氟（PMSF）10μl/ml]，冰上反复吹吸10min，4Ⅸ下，以离心半径为8 cm、12000 r/min离心10min，取上清，以小牛血清白蛋白（BSA）为标准品检测蛋白质含量，－20Ⅸ贮藏，备用。

2.6 Western blot检测p53蛋白

常规SDS-PAGE凝胶电泳（5%的浓缩胶，10%的分离胶，蛋白质上样量60μg，30 mA恒流，待溴酚蓝至胶底端1 cm时停止电泳）；依据蛋白Marker切取凝胶（含目的蛋白）及等尺寸的滤纸、硝酸纤维素薄膜（NC膜），半干式电转仪转膜45～55min；取NC膜，以TBST清洗2～3次，5min/次，5%脱脂奶粉封闭2 h，TBST清洗NC膜10min/次（2～3次）后，转入1∶500稀释的一抗（β-actin、p53）中，4Ⅸ过夜；TBST清洗NC膜3次（10min/次），HRP辣根过氧化物酶（二抗，稀释倍数1∶5000，V/V）室温孵育1 h，TBST洗涤（10min/次，2～3次），加入 ECL发光试剂，全自动凝胶成像仪成像（每5s成像1次，成像300s），Quantity One分析软件分析[9]。

2.7 流式细胞仪测定Hela细胞的凋亡

0.02、0.06、0.10mg/ml的姜黄提取液作用于Hela细胞24h，消化、收集细胞，PBS清洗，用于凋亡和周期（70%冷乙醇固定，过200目网，调整细胞数为1×106ml－1）各时相变化的检测[10]。

3 结果

3.1 姜黄素提取率计算结果

40 g姜黄粗提物，经酸碱法纯化得姜黄素0.3696 g，萃取法得0.6664 g。提取率依次为0.924%和1.666%，萃取法提纯是酸碱法的1.8倍，因此选择萃取法提取。

3.2 姜黄素含量计算结果

回归方程为A＝423.71 c－0.0566（r2＝0.9907），姜黄提取液中姜黄素含量为58.34%。

3.3 姜黄素对Hela细胞增殖的抑制作用

姜黄提取液质量浓度为0.2mg/ml（含姜黄素116.68μg/ml）时其抑制率达到峰值63.20%，半数抑制质量浓度（IC50）为0.33mg/ml（含姜黄素 192.52μg/ml），且抑制率在 0.05～0.2mg/ml质量浓度范围内随质量浓度增高而增大（P＜0.01）。姜黄素对Hela细胞增殖的抑制作用见表1。

表1 姜黄素对Hela细胞增殖的抑制作用（，n＝3）Tab 1 Inhibitory effects of different concentrations of curcumin on the growth of Hela cells in 24h（，n＝3）

表1 姜黄素对Hela细胞增殖的抑制作用（，n＝3）Tab 1 Inhibitory effects of different concentrations of curcumin on the growth of Hela cells in 24h（，n＝3）

姜黄素提取液质量浓度，mg/ml 0.050.100.150.200.250.300.350.400.450.50姜黄素质量浓度，μg/ml 29.1758.3487.51116.68145.85175.02204.19233.36262.53291.7 O D 0.437±0.0310.314±0.0310.205±0.0130.170±0.0080.210±0.0080.256±0.0210.257±0.0180.268±0.0130.277±0.0140.286±0.086抑制率，%15.3437.3156.9063.2056.0047.7947.7345.6444.0242.46

3.4 姜黄素对Hela细胞形态学的影响

加入0.02mg/ml（含姜黄素11.67μg/ml）、0.06mg/ml（含姜黄素35.00μg/ml）、0.10mg/ml（含姜黄素58.34μg/ml）姜黄提取液培养24h的Hela细胞，其细胞数目明显少于空白对照，且细胞变圆、缩小、老化，核质发散，并随浓度的升高，凋亡明显。Hela细胞的形态学见图1。

图1 Hela细胞的形态学A.空白对照组；B.0.02mg/ml姜黄提取液组；C.0.06mg/ml姜黄提取液组；D.0.10mg/ml姜黄提取液组Fig 1 Morphology of Hela cellsA.blank control group；B.0.02mg/ml C.longa extract；C.0.06mg/mlC.longa extract；D.0.10mg/mlC.longa extract

3.5 姜黄素对Hela细胞p53蛋白表达的影响

质量浓度为0.05mg/ml（含姜黄素29.17μg/ml）、0.25mg/ml（含姜黄素145.85μg/ml）时姜黄提取液作用Hela细胞24h，p53蛋白的表达与空白对照比较明显增强。Hela细胞p53蛋白的表达见图2（图中0mg/ml为空白对照）。

图2 Hela细胞p53蛋白的表达Fig 2 The expression of p53protein in Hela cells

3.6 姜黄素对Hela细胞凋亡的影响

姜黄提取液处理24h后，早期凋亡细胞所占的百分比由0.74%增加到1.43%，晚期凋亡细胞由2.45%增加到96.50%，即姜黄素诱导Hela细胞的死亡性质为凋亡，且其作用具有明显剂量依赖性。Hela细胞凋亡见图3。

图3 Hela细胞凋亡A.空白对照组；B.0.02mg/ml姜黄提取液组；C.0.06mg/ml姜黄提取液组；D.0.10mg/ml姜黄提取液组Fig 3 The apoptosis of Hela cellsA.blank control group；B.0.02mg/ml C.longa extract；C.0.06mg/mlC.longa extract；D.0.10mg/mlC.longa extract

3.7 姜黄素对Hela细胞周期的影响

不同质量浓度姜黄提取液（姜黄素质量浓度同“3.4”项下）处理24h后，G2/M期细胞比例由5.02%增至16.96%，同时G0/G1期与S期细胞比例减少，提示姜黄素使Hela细胞周期阻滞在G2/M期，从而抑制细胞增殖。Hela细胞周期分布见表2（表中0mg/ml为空白对照）。

表2 Hela细胞周期分布Tab 2 The cycle distribution of Hela cells

4 讨论

宫颈癌现已成为危害女性健康的第二杀手。我国每年新发病例14万，占妇女生殖道恶性肿瘤的第1位[11-12]。细胞凋亡始终是肿瘤的分子生物学研究热点[13]。p53蛋白表达与宫颈癌的发生有关[14-15]，且在细胞周期调控、细胞凋亡诱导等过程中发挥重要作用。本文以Hela细胞为研究对象，探讨姜黄素对Hela细胞生长、凋亡及p53蛋白表达的影响。结果表明，姜黄素对Hela细胞有较明显的抑制作用，在116.68μg/ml附近出现抑制率峰值，在一定质量浓度范围内，姜黄素作用Hela细胞24h，p53蛋白表达随质量浓度增加而增强；细胞流式仪检测细胞凋亡数目相对增多；姜黄素对Hela细胞G2期有阻滞，从而使G1期和S期细胞相对减少，G2/M期细胞相对增多，即对Hela细胞G2/M期有明显的阻滞作用，使细胞凋亡率增高。

肿瘤的发生发展与细胞凋亡有关，诱导细胞凋亡已成为肿瘤治疗的热点，亦成为评估抗癌药物作用能力的重要指标。由于姜黄素对肿瘤细胞的作用并非针对单一靶点，具有广泛的生物学作用，因此对姜黄素诱导Hela细胞凋亡机制的进一步研究以及阻滞细胞传导通路、信使的相关研究，将对其临床应用具有良好的指导意义。

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