MSC治疗小鼠OB模型排斥反应的作用研究

史乾 李静 范慧敏

·论著·

MSC治疗小鼠OB模型排斥反应的作用研究

史乾 李静 范慧敏

目的研究间充质干细胞(MSC)免疫抑制功能在治疗小鼠闭塞性细支气管炎(OB)中的作用。方法分离C57BL/6小鼠骨髓MSC, 建立小鼠气管移植后OB反应模型, 移植当天给予MSC, 30 d后处死小鼠, 移植气管HE染色, 观察移植气管急性排斥反应的发生情况。并用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测移植排斥相关炎症因子的含量。结果MSC治疗移植组与异系移植组相比, 排斥反应得到缓解, 与无排斥反应的同系移植对照组相似, 移植气管管腔阻塞程度缓解。移植气管ELISA检测发现, MSC治疗移植组小鼠体内炎症因子IFN-g下降, 而抑炎因子白细胞介素-10(IL-10)上升。结论MSC能缓解小鼠气管移植后OB反应, 并调节体内免疫状态, 抑制炎症。

间充质干细胞；闭塞性细支气管炎；白细胞介素-10

肺移植和心肺联合移植是治疗多种终末期心肺疾病的重要措施, 尽管免疫抑制剂的广泛使用能较为有效的防治急性期排斥, 然而其对慢性排斥的作用却收效甚微。肺移植排斥最主要的慢性排斥反应表现为闭塞性细支气管炎(obliterative bronchiolitis, OB), 是限制肺移植患者长期存活的主要原因［1,2］。

间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSC)被认为不但能分化成不同类型的细胞系, 而且具有免疫调节功能［3,4］。由于MSC具有低免疫原性等特点, 因此同种异体的MSC可逃逸宿主的免疫清除, 在细胞移植方面颇具优势。因此本课题将利用小鼠原位气管移植模型探讨MSC干预肺移植后OB的作用。现报告如下。

1 材料与方法

1.1实验动物与分组 近交系雄性C57BL/6小鼠, 体重20～25 g；近交系雄性BALB/c小鼠, 体重20～25 g。均购于上海斯莱克实验动物有限公司［许可证号SCXK(沪)2007-0005］。饲养于同济大学实验动物中心无特定病原体(SPF)动物房。该实验得到同济大学附属上海市东方医院伦理委员会批准。分组为同系移植对照组：C57BL/6→C57BL/6, 8例；异系移植组：BALB/C→C57BL/6, 8例；MSC治疗移植组：BALB/C→C57BL/6 + MSC输注, 8例。

1.2小鼠原位气管移植模型的建立

1.2.1供体手术 术前12 h禁食、禁水。1%戊巴比妥钠溶液, 0.1 ml/10 g腹腔注射小鼠麻醉。供体颈前正中切口, 游离气管, 取6个软骨环长度气管一段, 置4℃生理盐水备用。

1.2.2受体手术 同供者, 颈前正中切口, 游离气管。纱布吸干供体气管后缝合尾侧, 将供体气管尾侧同受体尾侧气管膜部正中处缝合打结, 分别于尾侧气管3、9、12点方位各缝合一针并打结, 对合整齐。相同方法缝合头侧气管。将两侧颈部肌肉覆被移植气管后缝合, 缝合皮肤。

1.3标本收集 移植术后30 d处死小鼠。取移植气管约5个气管环, HE染色后, 显微镜下观察小鼠气管病理切片, 通过QWin软件分析组织图片数据。

1.4ELISA检测 取移植气管约5个软骨环, 加入500 µl PBS, 匀浆后离心取上清液, 使用eBioscience IL-10、IFN-g ELISA kit, 分别在酶标仪450 nm及570 nm处读取吸光度。

1.5统计学方法 所得所有数据均采用SPSS13.0统计软件处理。计量资料以均数±标准差)表示, 采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1体外分离培养MSC 骨髓培养法从C57BL/6小鼠的骨髓中分离MSC。骨髓细胞接种于塑料培养瓶后, 细胞在培养瓶散在分布, 呈圆形。24 h后就见有细胞贴壁。72 h首次全量换液去除未贴壁细胞, 此时贴壁细胞胞体明显增大并开始分裂增殖, 细胞形态渐变为梭形或纺锤形。流式细胞术检测各分子的表达水平, CD105(96.1±8.5)%、CD29(97.7±9.5)%、SCA-1(96.3±10.7)%, CD45(2.34±1.5)%, CD11b(1.41±0.7)%。该群细胞不表达CD45和CD11b, 高表达CD105、CD29和SCA-1。符合小鼠骨髓来源间充质干细胞的表型特点。进而在分化功能检测中, 作者发现这些细胞可以分化成为脂肪细胞和成骨细胞。

2.2MSC输注治疗OB模型排斥反应效果 各标本可见各组小鼠气管吻合口均愈合良好, 无严重狭窄。同系移植对照组小鼠移植气管与周围结缔组织粘连较轻, 气管形态接近正常, 管壁可见柱状上皮细胞及纤毛, 管壁内未见炎性细胞浸润或管腔闭塞。而异系移植组小鼠移植气管与周围结缔组织粘连较重, 可见黏膜水肿、糜烂, 及上皮纤毛脱失, 内膜增厚明显, 伴随大量中性粒细胞、淋巴细胞浸润, 提示存在免疫排斥反应。术后30 d病理学染色结果显示体外培养的MSC培养2代后进行过继输入作为MSC治疗移植组, 与异系移植组对比, MSC治疗移植组炎性细胞浸润明显减轻, 内膜增厚程度明显轻于异系移植组。见图1。

图1 小鼠原位气管移植1个月后气管病理切片

2.3MSC对移植模型体内炎症状态影响 为分析MSC如何缓解OB排斥反应, 作者检测各组模型体内的炎症因子水平,评价MSC对免疫系统的作用。通过ELISA方法检测移植物局部抑炎因子IL-10和促炎因子IFN-g水平, 作者发现MSC治疗移植组IL-10水平与其他两组比较明显升高(P＜0.05), 而IFN-g水平下降(P＜0.05)。见图2。

图2 各组移植气管炎症因子检测分析结果

3 讨论

肺移植是治疗终末期肺脏疾病唯一有效的方法［5］。尽管近些年来新的抗移植排斥药物的应用, 以及外科技术的改进使得肺移植术成功率明显增加, 但肺移植术后患者的长期存活率依然很低, 而肺移植后的慢性排斥反应是患者长期生存的主要障碍, 使肺移植患者5年生存率低于50%。因此,探索有效的预防和治疗肺移植术后OB的策略尤为重要。

近年的研究发现, 除了多向分化潜能之外, 免疫调节功能也是MSC的重要功能之一。体内研究［6］发现MSC能通过改变T淋巴细胞和树突状细胞(DC)的迁移能力改善急性移植物抗宿主病(GVHD)。同时, MSC能有力地下调其表面CD11c、CD80、CD86及CD40的表达, 上调CD11C的表达,细菌脂多糖(LPS)不能逆转此改变, 而且这种MSC处理的DC具有较高的胞吞能力、低免疫源性和较强的免疫调节功能［7］。

MSC可通过细胞接触, 或者通过其产生的细胞因子发挥免疫调节功能［8］。尽管在体内研究中, 作者发现过继输入MSC明显增加了体内IL-10的表达。本研究通过建立小鼠原位气管移植模型, 于术后第30天排斥反应期检测移植气管病理变化及相关炎症因子的含量, 探讨MSC在移植后OB反应中的作用。作者发现MSC过继输入到小鼠OB模型的体内,可明显减轻气管移植物的病理改变, 并缓解移植气管阻塞的程度。进一步对移植气管炎症因子的含量测定发现, MSC治疗小鼠后, 移植气管IL-10明显升高, IFN-g降低, 提示了MSC能调节免疫状态抑制排斥。因此, 研究为深入探索MSC发挥免疫调节作用的机制并将这群细胞用于临床奠定一定的实验基础。在后续试验中, 作者将进一步在大动物OB模型中验证MSC治疗排斥反应的有效性和可靠性, 为临床转化应用提供理论基础。

［1］ Hardy JD, Wobb WR , Dalton ML Jr, et al.Lung Homotransplantaion in man.JAMA, 1963:186.

［2］ 范慧敏, 刘中民, 郭建华, 等.心肺联合移植治疗艾森曼格综合征4例.中华器官移植杂志, 2006, 27(5):294-296.

［3］ Zappia E, Casazza S, Pedemonte E, et al.Mesenchymal stem cells ameliorate experimental autoimmune encephalomyelitis inducing T-cell anergy.Blood, 2005, 106(5):1755-1761.

［4］ Peister A, Mellad JA, Larson BL, et al.Adult stem cells from bone marrow (MSCs) isolated from different strains of inbred mice vary in surface epitopes, rates of proliferation, and differentiation potential.Blood, 2004,103(5):1662-1668.

［5］ Casiraghi F, Azzollini N, Cassis P, et al.Pretransplant Infusion of Mesenchymal Stem Cells Prolongs the Survival of a Semiallogeneic Heart Transplant through the Generation of Regulatory T cells.Journal of immunology, 2008,181(6):3933-3946.

［6］ Mao F, Xu W, Qian H, et al.Immunosuppressive effects of mesenchymal stem cells in collagen-induced mouse arthritis.Inflamm Res, 2010,59(3): 219-225.

［7］ Cao H, Lan Q, Shi Q, et al.Anti-IL-23 antibody blockade of IL-23/ IL-17 pathway attenuates airway obliteration in rat orthotopic tracheal transplantation.Int Immunopharmacol, 2011, 11(5):569-575.

［8］ Burlingham WJ, Love RB, Jankowska-Gan E, et al.IL-17-dependent cellular immunity to collagen type V predisposes to obliterative bronchiolitis in human lung transplants.The Journal of clinical investigation, 2007,117(11):3498-3506.

Effect study of rejection of MSC in treatment of mice OB model

SHI Qian, LI Jing,
FAN Hui-min.Department of Cardiac surgery, Shanghai East Affiliated Hospital of Tongji University/Institute of Cardiac Failure, Shanghai 200120, China

ObjectiveTo analyze the effect of immunosuppression of mesenchymal stem cell (MSC) in the treatment of mice obliterans bronchiolitis (OB).MethodsMarrow MSC of C57BL/6 mice was separated to set OB reaction model after trachea transplantation of mice.MSC was given on the day of transplantation.The mice were put to death after 30 days.HE staining was used on the transplanted trachea, and the situation of acute rejection of transplanted trachea was observed.Enzyme-linked immuno sorbent assay (ELISA) was applied to detect the content of inflammatory factors related to transplant rejection.ResultsRejection reaction in MSC transplant group was eased, compared with different system transplant group, and degree of lumen obstruction in transplanted trachea was also eased, compared with allografts transplant control group without rejection.ELISA test for transplanted trachea showed that inflammatory factor IFN-g decreased in MSC transplant group, while anti-inflammatory factor interleukin-10 (IL-10) increased.ConclusionMSC can ease the OB reaction after trachea transplantation, adjust immune state and inhibit inflammation.

Mesenchymal stem cell; Obliterans bronchiolitis; Interleukin-10

2014-07-23］

国家自然科学基金项目(项目编号：81200062, 31200678)；上海市卫生局青年科研项目(项目编号：20114Y148)

200120 同济大学附属上海市东方医院心外科, 心力衰竭研究所

范慧敏