TPM1在鼻咽癌中的表达及其临床意义

王亮 林建立

TPM1在鼻咽癌中的表达及其临床意义

王亮 林建立

目的观察TPM1基因的表达与鼻咽癌(NPC)的关系。方法采用实时定量rt-PCR技术检测TPM1基因在NPC细胞株(CNE1、CNE2、58F)和鼻咽上皮细胞株(NP69)中的表达；采用组织芯片技术通过免疫组化检测TPM1在124例恶性鼻咽癌肿瘤、31例对应的癌旁正常组织和12例正常鼻咽黏膜组织的表达。结果TPM1 mRNA在NP69中表达水平较高, 而在NPC细胞株中表达水平显著下降。正常鼻咽黏膜及癌旁组织中TPM1蛋白染色阳性表达率约为65.1% (28/43)；而在鼻咽癌组织中阳性表达率约为34.7%(43/124)；TPM1蛋白表达水平与肿瘤的侵犯范围(T)呈负相关(P＜0.05), 与颈淋巴结转移(N)无关(P＞0.05)。结论TPM1基因表达的抑制可能参与鼻咽癌的发生。

TPM1；鼻咽癌；基因表达

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是我国南方较高发的恶性肿瘤, 严重危害公众健康, 其病因目前尚不明确。患者初诊时常伴有颈部淋巴结转移, 因此急需寻找能用于鼻咽癌早期诊断以及预后的生物标志物, 为早期诊断和治疗提供线索。

原肌球蛋白(tropomyosin, TM)是一种在肌肉收缩过程中扮演重要角色的调节蛋白, 在细胞运动和促使细胞凋亡等方面具有重要作用［1］。TM广泛分布于各种真核细胞中, 在肌肉(如骨骼肌、心肌和平滑肌)和非肌肉细胞中均有表达［2］。TM家族包括TPM1、TPM2、TPM3和TPM4四个成员［3,4］,有研究表明, TPM1 在肿瘤发生中发挥着重要的作用, 乳腺癌、膀胱癌和神经纤维瘤等肿瘤中［5-7］, TPM1 表达明显低于正常组织, 而 TPM1在鼻咽癌中的表达尚未见报道。

本研究通过对鼻咽癌细胞株和鼻咽上皮细胞株的TPM1基因mRNA表达水平的检测并利用组织芯片配合免疫组化观察TPM1蛋白表达在鼻咽癌组织和正常及癌旁组织中的差异, 探讨TPM1的表达与鼻咽癌之间的关系及其临床意义。现报告如下。

1 材料与方法

1.1材料及主要试剂 Trizol 试剂购自Invitrogen公司； 反转录酶购自 TaKaRa 公司；荧光定量PCR MIX(SYBR染料法)购自ABI公司。胎牛血清及 RPMI1640 培养基购自 Gibco 公司；组织芯片NPC961和NPC962购自西安艾丽娜生物科技有限公司；兔抗人TPM1抗体(ab55915)购于 Abcam 公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG购于碧云天生物公司。

细胞培养：3株鼻咽癌细胞CNE1、CNE2、58F和1株鼻咽上皮细胞NP69由中山大学肿瘤中心康铁邦教授惠赠；用含 10% 胎牛血清的 RPMI1640 培养基在 5% CO2、37℃培养箱内培养。

1.2方法 rt-PCR检测TPM1mRNA的表达, Trizol提取总RNA,采用反转录酶(TaKaRa)按说明书合成cDNA。PCR扩增引物由华大生物技术有限公司合成：TPM1基因引物上游：5'-CCGTAAGCTGGTCATCATT-3',下游：5'-TCTCTTCCTCATATCTGTCTTC-3',产物长度176bp；actin引物上游：5'-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3',下游：5'-GCTGTCACCTTCACCTTTCC-3',产物长度268 bp。采用20 µl的反应体系,每个样本重复3次,求平均Ct值作为实验结果。反应过程具体为：95℃预变性3 min；95℃变性13 s, 59℃退火和延伸45s,扩增40个循环。计算ΔCT=Ct(TPM1)-Ct(actin)；再根据ΔΔCT=ΔCT(肿瘤细胞株)-ΔCT(NP69),进一步计算TPM1在肿瘤细胞株与NP69之间表达倍数的差异。

1.3组织芯片及免疫组化分析 组织芯片NPC961和NPC962包含124例原发性鼻咽癌肿瘤、31例对应的癌旁正常组织和12例正常鼻咽黏膜组织。组织芯片经二甲苯脱石蜡, 乙醇再水化, PBS清洗, 置于0.01 M柠檬酸缓冲液(pH 6.0)在微波炉中加热使抗原复活, 3% H2O2中室温浸泡10 min封闭内源性过氧化物酶活性, 抗-TPM1于4℃孵育过夜, 滴加二抗工作液, DAB显色剂显色, 苏木精复染后, 中性树胶封片,于普通显微镜下观察。

1.4统计学方法 采用SPSS19.0版统计软件。计数资料相关性分析及率的比较用Pearson’s χ2检验或Fisher’s精确检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1TPM1在鼻咽癌细胞株中的表达 为了比较TPM1在鼻咽癌细胞和正常细胞间的表达差异, 作者分别利用实时定量rt-PCR比较了高分化型鼻咽癌细胞株CNE1、低分化型鼻咽癌细胞株CNE2、高转移型鼻咽癌细胞株58F和鼻咽上皮细胞株NP69中TPM1的mRNA表达水平。结果表明, 在正常鼻咽上皮细胞株NP69中TPM1的mRNA表达水平较高, 而在3种鼻咽癌细胞株中表达水平均显著下降, 见图1。

2.2TPM1蛋白在组织中的表达及与临床病理因素的关系鼻咽癌组织中TPM1蛋白染色主要位于细胞质内, 呈棕黄色, 见图2。在43例正常鼻咽黏膜及癌旁组织中有28例为明显TPM1蛋白染色, 阳性表达率约为65.1%；而在124例鼻咽癌组织中则有43例为TPM1蛋白染色阳性, 阳性表达率约为34.7%；正常及癌旁组织中的TPM1蛋白阳性率明显高于鼻咽癌组织(P＜0.01)见表1。TPM1蛋白表达水平与肿瘤的侵犯范围(T)呈负相关(P＜0.05), 与颈淋巴结转移(N)无关(P＞0.05), 见表2。

图1 TPM1 mRNA在NP69、CNE1、CNE2、58F细胞株中的相对表达水平

图2 TPM1在组织中的表达

表1鼻咽癌组织及正常组织中TPM1蛋白免疫组化检测结果

表2TPM1表达与临床病理特征的关系

3 讨论

原肌球蛋白是肌肉收缩过程中重要的调节蛋白, 广泛分布于各种真核细胞中。研究表明, 在非肌肉细胞中, TPM1发挥着细胞转化抑制剂的作用, 一旦 TPM1 受损或缺失, 将导致细胞恶性转化, 但具体过程仍不清楚。作者通过实时定量rt-PCR检测3种鼻咽癌细胞株(CNE1、CNE2、58F)和NP69中TPM1基因mRNA的表达, 发现相对于NP69细胞株, CNE1、CNE2和58F细胞株中TPM1基因mRNA表达显著下降,提示TPM1基因表达抑制可能与鼻咽癌发生有关。原位杂交和免疫荧光实验证实, 在正常乳腺组织中可检测到TPM1 mRNA和蛋白表达, 而在乳腺癌中TPM1表达受抑制［5］。现已证明TPM1基因启动子甲基化是其在乳腺癌中表达受抑制的主要机制, 而上调TPM1基因的表达则表现出抑制细胞增值的效果［8］。这些结果都表明TPM1表达抑制可能与肿瘤发生有关。

作者的研究发现, TPM1在34.7%(43/124)的鼻咽癌组织中有表达。在正常的鼻咽上皮组织及癌旁组织中, TPM1蛋白为65.1%(28/43)的阳性表达率, 表明相对于正常组织而言, TPM1蛋白在鼻咽癌组织中表达受到抑制。这种差异表达提示TPM1蛋白在鼻咽癌的发生中可能具有一定的作用。进一步与临床病理因素的相关分析发现TPM1蛋白表达水平与肿瘤的侵犯范围(T)呈负相关(P＜0.05)。由此可以推断TPM1的表达水平可以反映肿瘤细胞的增值程度与分化状态。

综上所述, 本研究通过比较鼻咽癌细胞株和鼻咽上皮细胞株中TPM1基因的mRNA表达水平的差异, 发现该基因的表达在鼻咽癌细胞株中存在较为显著的表达抑制。组织芯片免疫组化结果发现TPM1蛋白在肿瘤组织中表达率显著低于在正常组织和癌旁组织中的表达率且TPM1蛋白表达水平与肿瘤的侵犯范围(T)呈负相关。以上结果表明TPM1基因表达的抑制可能参与鼻咽癌的发生。

［1］ Lin JJ, Warren KS, Wamboldt DD, et al.Tropomyosin isoforms in nonmuscle cells.Int Rev Cytol, 1997(170):1-38.

［2］ Lees-Miller JP, Helfman DM.The molecular basis for tropomyosin isoform diversity.Bioessays , 1991(13):429-437.

［3］ Lin JJ, Eppinga RD, Warren KS, et al.Human tropomyosin isoforms in the regulation of cytoskeleton functions.Adv Exp Med Biol, 2008, 6(44):201-222.

［4］ Vrhovski B, Theze N, Thiebaud P.Structure and evolution of tropomyosin genes.Adv Exp Med Biol, 2008(644): 6-26.

［5］ Raval GN, Bharadwaj S, Levine EA, et al.Loss of expression oftropomyosin-1, a novel class II tumor suppressor that induces anoikis, in primary breast tumors.Oncogene, 2003(22):6194-6203.

［6］ Pawlak G, McGarvey TW, Nguyen TB, et al.Alterations in tropomyosin isoform expression in human transitional cell carcinoma of the urinary bladder.Int J Cancer, 2004(110):368-373.

［7］ Yager ML, Hughes JA, Lovicu FJ, et al.Functional analysis of the actin-binding protein, tropomyosin 1, in neuroblastoma.Br J Cancer, 2003(89):860-863.

［8］ Bharadwaj S, Prasad GL.Tropomyosin-1, a novel suppressor of cellular transformation is downregulated by promoter methylation in cancer cells.Cancer Lett, 2002(183):205-213.

TPM1 expression and its clinical significance in nasopharyngeal carcinoma

WANG Liang, LIN Jian-li.
School of Medicine, Shenzhen University, Shenzhen 518060, China

ObjectiveTo investigate the relation between TPM1 gene expression and nasopharyngeal carcinoma (NPC).MethodsTPM1 expression was examined in three NPC cell lines (CNE1, CNE2 and 58F) and one nasopharyngeal epithelial cell line (NP69) by real time rt-PCR analysis and in tissue array with 124 specimens of malignant NPC, 31 NPC specimens adjacent areas and 12 normal mucosa tissues by immunohistochemistry staining.ResultsCompared to NP69, TPM1 mRNA expression level is significantly lower in three NPC cell lines.The positive rates of TPM1 protein were 65.1% (28/43) in NPC specimens adjacent areas and normal mucosa tissues and were 34.7% (43/124) in malignant NPC tissues.The expression of TPM1 protein in NPC was negatively related to that in degree of infiltration (T) (P＜0.05) but not related to that in lymph node metastasis (N) (P＞0.05).ConclusionDown-regulated of TPM1 expression may be associated with the tumorigenesis of NPC.

TPM1; Nasopharyngeal carcinoma; Gene expression

2014-06-18］

518060 深圳大学医学部

王亮