富氢水抗1型糖尿病小鼠肾脏氧化应激的作用

赵晨晨，王清清，邱朋程，朱鹏磊，苏中钱，毛雨彦，宋张娟，金可可

（温州医科大学，浙江 温州 325035，1.第一临床医学院；2.环境与公共卫生管理学院；3.病理生理学教研室）

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病常见的微血管并发症，氧化应激参与DN的发生、发展过程。研究表明，糖尿病发生时，高血糖可促使NADPH氧化酶4（NADPH oxidase 4，Nox4）异常激活，产生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS）[1]。血红素加氧酶-1（hemeoxygenase-1，HO-1）是体内重要的内源性抗氧化物质，氧化应激发生时，HO-1通过分解血红素，产生抗氧化物质，保护机体。近年研究证明氢气可选择性中和自由基，如羟基（·OH）和过氧亚硝酸根（ONOO-），且氢气分子量小，能够以扩散方式快速到达靶细胞，发挥抗氧化作用[2]。本研究旨在观察富氢水对糖尿病肾脏组织Nox4和HO-1蛋白表达的影响，探讨富氢水对糖尿病肾脏的可能保护机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物 60只健康雄性ICR小鼠，体质量18～22 g，购自温州医科大学实验动物中心。

1.2 药物及试剂 链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）购自美国Sigma公司；血糖仪及试纸购自美国强生公司；富氢水购自上海第二军医大学潜水医学教研室；HO-1、Nox4多克隆抗体和DAB显色试剂盒购自河北博海生物工程开发有限公司。

1.3 模型建立与分组 60只小鼠随机分成3组：空白对照组（A组）、糖尿病组（B组）、糖尿病富氢水干预组（C组），每组20只。用0.1 mol/L枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液将STZ配制成1%的溶液。小鼠禁食12 h后，B组和C组按150 mg/kg剂量一次性腹腔注射STZ溶液诱发糖尿病，A组注射等体积缓冲液。给药7 d后，禁食12 h，尾静脉采血，测定小鼠空腹血糖＞11.0 mmol/L认定造模成功。B组和C组各造模成功13只。小鼠糖尿病模型建立后，C组每天腹腔注射5 mL/kg的富氢水，B组每天腹腔注射等量0.9%氯化钠溶液，每2周测定小鼠体质量及血糖。8周后，处死小鼠，游离肾脏，洗净吸干。取部分肾脏组织固定于4%多聚甲醛，石蜡包埋，制成5μ m厚度切片，其余肾脏组织冻存于-80 ℃冰箱备用。

1.4 免疫组织化学检测 采用免疫组织化学SP法，按试剂盒说明书操作，采用DAB显色。光镜标本每张切片随机取5个视野，多功能真彩色细胞图像分析管理系统进行分析，计算免疫组织化学评分（immunohistochemical scores，IHS）。IHS=阳性细胞数分级×阳性细胞显色强度分级。

1.5 统计学处理方法 应用SPSS17.0软件。实验数据以±s表示，组间差异比较采用方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血糖 B组与C组的空腹血糖值均明显高于A组（P＜0.01），B组与C组之间差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 3组小鼠空腹血糖值比较

2.2 肾脏组织HE染色观察 肉眼观察3组小鼠肾脏形态正常，结构清晰。HE染色光镜下见3组肾小球基底膜厚度均匀，无足突细胞融合；肾小管细胞无增生肥大，无肿胀；系膜细胞无肿胀，无基质增生。见图1。

2.3 肾脏Nox4和HO-1蛋白表达 3组小鼠肾脏Nox4和HO-1均有阳性表达，与B组比较，C组Nox4表达明显降低，但2组均高于A组（见图2、表2），同时C组HO-1表达增多，且明显高于A组和B组（见图3、表2）。

图1 3组小鼠肾脏组织HE染色结果（×200）

图2 3组小鼠肾脏Nox4蛋白表达（SP，×400）

图3 3组小鼠肾脏HO-1蛋白表达（SP，×400）

表2 3组小鼠肾脏Nox4和HO-1 IHS（±s）

表2 3组小鼠肾脏Nox4和HO-1 IHS（±s）

与A组比：aP＜0.01；与B组比：bP＜0.01

组别 n Nox4 HO-1 A组 20 1.05±0.22ab 3.85±0.37ab B组 13 3.92±0.28ab 3.08±0.28ab C组 13 2.15±0.38ab 7.54±0.88ab

3 讨论

本研究结果显示，糖尿病小鼠肾脏Nox4表达显著升高，而HO-1降低，提示糖尿病动物的肾脏氧化应激水平升高。C组与B组比较，Nox4水平明显下降，HO-1表达量增加，而2组小鼠空腹血糖值差异无统计学意义，表明富氢水无明显降血糖作用，但在高血糖状态下可发挥抗氧化作用，明显降低肾脏氧化应激水平。

Nox4是NADPH氧化酶催化亚基gp91phox的同源物，主要在肾脏中表达，参与肾脏的正常功能调节。糖尿病发生时，持续的高血糖促使Nox4异常激活，Nox的活化依赖于蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）介导的磷酸化，Nox络合物形成后促使ROS大量生成，过多的ROS激活磷脂酶C（phospholipase C，PLC）使得细胞膜中的磷脂酰肌醇分解[3]，产生第二信使二酰基甘油（diacylglycerol，DAG），DAG又可以激活PKC，由此形成恶性循环，加重肾脏损伤。氢分子已在大量实验中被证实具有抗氧化应激作用，本实验中富氢水可通过减少Nox4表达，以减弱氧化应激循环。Yu等[4]在原发性高血压大鼠模型中也发现，以6 mL/（kg·d）的剂量连续应用富氢水3个月后，左心室Nox2和Nox4表达明显减少，氧化应激水平降低，左室肥厚进程减缓。

HO-1是体内重要的内源性抗氧化物质，其生理作用在于催化血红素分解成CO、铁和胆绿素，这些物质均具有抗氧化作用。Zhai等[5]给脑膜中动脉闭塞的大鼠口服乳果糖，诱发内源产氢，通过RT-PCR和蛋白印记法检测NF-E2相关因子2（NF-E2-related factor 2，Nfr2）表达量，结果发现乳果糖处理组Nrf2 mRNA及Nrf2蛋白表达均高于对照组，由此推断氢气可以激活Nrf2表达。Kawamura等[6]将Nrf2基因敲除小鼠暴露于高氧环境下60 h，结果氢治疗的小鼠肺氧化应激水平降低，但HO-1合成量不变，而Nrf2基因未敲除小鼠，接受氢治疗后氧化应激水平降低，HO-1及Nrf2 mRNA合成量增加。本实验中，糖尿病小鼠腹腔注射富氢水8周后，HO-1表达增加，其机制可能与氢气激活HO-1的调控因子Nfr2有关。氢气激活Nrf2的过程涉及氧自由基及内源性抗氧化系统[5]，其具体机制还有待进一步研究。

Chihiro等[7]在缺血再灌注模型中验证富氢水对肾脏的保护作用，24 h的富氢水治疗能明显减轻肾水肿，改善间质充血，减弱炎症反应。大鼠肾脏缺血再灌注损伤后，血肌酐、尿素氮等明显增高，富氢水的处理能显著降低这些指标，改善肾功能[8]。但本研究中，B组及C组肾组织学切片均未发现明显病变，可能因小鼠尚处于DN的早期，损害程度较轻微，无法从大体及光镜下观察到富氢水对糖尿病肾脏的保护作用。

在糖尿病方面，Kamimura等[9]证实饮用氢水后，小鼠血糖及甘油三酯含量均降低。Kajiyama等[10]对6例糖耐量受损患者进行安慰剂对照试验，发现饮用氢水后，2/3的患者糖耐量恢复正常。但本实验中富氢水对小鼠血糖的影响不明显，这可能与不同实验中所使用的氢剂量差异有关。同时，在糖尿病视网膜病模型中，大鼠饮氢水4周，caspase-3活性减弱，视网膜细胞凋亡减少，但该研究也未得出氢水对血糖有改善作用的结论[11]。所以富氢水对血糖的影响还有待进一步明确。