嘌呤受体亚型(P2Y2)在肛门直肠畸形动物模型直肠末端的表达

孔 萌，刘远梅, 金 祝,曲 颜，郑泽兵

(遵义医学院附属医院 小儿普胸泌外科，贵州 遵义 563099)

先天性肛门直肠畸形 (anorectal malformation, ARM)是小儿最常见的消化道畸形之一[1]，虽本病的治愈率已显著提高，但术后部分ARM患儿仍可出现不同程度的污粪、便秘等排便功能障碍，给患儿的生活质量带来较大影响。目前已证实ARM患儿术后排便功能障碍与肠神经系统(enteric nervous system, ENS)发育异常密切相关[2]，而ENS发育异常又是如何影响其排便功能，作用机制仍不十分清楚。ENS起源于神经嵴细胞，进入肠道后逐渐迁移、增殖，缓慢集聚最终分化形成神经节细胞及胶质细胞[3]，在此过程中任何环节发生障碍均可影响神经节细胞的发育进而导致ENS发育不良。三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)作为一种重要的神经递质，主要参与神经元的增殖、分化、迁移、再生和修复，可影响ENS的发育，ATP功能的发挥必须与相应P2Y2受体结合[4]，P2Y2受体的多少可以间接反映ATP神经递质的功能。本实验通过乙烯硫脲(ethylenethiourea，ETU)制作ARM动物模型[5]，观察P2Y2受体在ARM胎鼠直肠末端中分布、表达情况，进一步探讨其在肠壁神经系统发育中的作用。

1 材料与方法

1.1 ARM动物模型的建立及分组 选用健康未经产成年SD大鼠40只(第三军医大学实验动物中心提供，SPF级)，其中雌鼠30只，雄鼠10只，体重200～250g，雌雄大鼠按3∶1 比例于晚10点合笼交配，次日清晨8点行雌鼠阴道涂片，光学显微镜(×100)暗视野下以见到精子记为孕0d，每只孕鼠分别于妊娠第0天和第10天进行称重，增重不明显的孕鼠不包括在本实验内，以排除流产和假孕现象。选取明确受孕的20只雌鼠随机分成两组：实验组与正常组各10只，实验组在孕10d 一次性灌胃注入125mg/kg的1%乙烯硫脲，正常组在孕10d灌胃注入等量生理盐水。两组孕鼠在孕20d剖宫取出所有宫内胎鼠，观察有无畸形，并取出部分胎鼠直肠末端保存于-80℃冰箱，其余标本用4%甲醛溶液固定12～36h，常规脱水，石蜡包埋。

1.2 主要仪器及试剂 实时定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)、Leica Qwin图像分析系统(德国Forma Scientic)、双色红外激光成像系统(美国GDYSSEY公司)、光学显微镜(德国Leica公司)、ETU(Sigma，1504-I00G)、DEPC原液(Sigma St.Louis MO)、RT-PCR试剂盒(大连宝生物试剂公司)、免疫组化染色试剂盒(北京中杉生物技术有限公司)、兔抗鼠P2Y2单克隆抗体(北京博奥生物公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 HE染色 对石蜡包埋好的盆腔会阴部组织及直肠末端组织进行连续切片，厚度约为4 μm，常规行HE染色，光学显微镜下观察两组胎鼠直肠末端组织结构变化并分别取10个样本切片，每张切片随机选取10个视野，计算出肌间及黏膜下神经元的数目，然后求10个视野平均值作该样本的表达量。

1.3.2 Western blot 检测 选取ARM组及正常组标本各10例，应用全蛋白提取试剂盒提取总蛋白，BCA法测定蛋白含量。Western blot杂交：取总蛋白60 μL，经10% SDS-PAGE后移至硝酸纤维膜上，5%脱脂奶粉封闭抗原后，加兔抗鼠P2Y2(1∶200)和β-actin 抗体(1∶1000)，4 ℃孵育12 h，然后用800cw标记的山羊抗兔 IgG(1∶10000)行二抗杂交，采用双红外激光成像系统扫描图像并对蛋白含量进行密度分析，以相对灰度值代表蛋白表达量。

1.3.3 qRT-PCR检测 基因引物由大连宝生物公司协助合成，β-actin基因，5′-GGA GATTACTGCCCTGGCTCCTA-3′、5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3′, 扩增长度150bp；P2Y2基因：5′-CTCATTTGGCAGGGACTCAGG-3′、5′- AATGGCA GCTGTTTGCATGG-3′，扩增长度141bp，采用逆转录试剂盒方法进行总RNA的提取以及逆转录合成cDNA。结果计算：测定每个样本P2Y2、β-actin基因的Ct值，计算该基因相对定量，确定各基因扩增效率在90%～105%，相关系数︱r︱>0.99，满足2^(-ΔCt)(参照基因的ΔCt法)相对定量分析的前提。以Ct值为统计参数计算下列数据：①Ct average =(Ct1+Ct2)/2(复管)；②dCt =Ct average-中间值；③基因的表达=2^(-dCt)；④相对定量=目的基因/内参基因(β-actin)的表达×100。

2 结果

2.1 大体观察 正常组共产胎鼠108只，存活率100%，未见任何畸形发生；实验组共产胎仔94只，存活率93.6%，存活胎鼠中ARM发生率96.8%。

2.2 HE染色 正常组胎鼠肛门开口正常，肛门周围肌肉轮廓清楚，直肠各层组织分化好(见图1A)，ARM胎鼠直肠末端为一闭合盲端，无正常肛门结构(见图1B)；正常组胎鼠直肠末端黏膜下和肌间神经元细胞数目多，核体积大，呈圆形或椭圆形，染色深，胞浆丰富，轴突清晰可见(见图1C)；ARM组各层组织结构分层不清，可见较多空腔，神经元细胞数目较少，核体积小，固缩，染色浅，呈不规则形，分布稀疏，轴突及胞浆少(见图1D)，ARM组神经元细胞数目较正常组明显减少(143.60±14.93 vs 335.90±10.46，P<0.01)，差异有统计学意义(见表1)。

注：A：正常组矢状面：肛门开口正常，轮廓清晰；B：ARM组矢状面：肛门开口处为一闭合盲端 ；C：正常组直肠末端肠壁各层分化好；D：ARM组胎鼠直肠末端肠壁黏膜下肌间神经元数量较少，层次不清，(放大倍数A-B：HE×40，C-D：HE×400)。图1 正常组和ARM组胎鼠盆腔会阴部和直肠末端HE染色结果

分组黏膜下和肌间神经元数目正常组ARM组335.90±10.46 143.60±14.93*tP10.5 0.00

注：*与对照组相比，P<0.01。

2.3 Western blot结果 P2Y2在ARM胎鼠直肠末端的蛋白表达量均明显低于正常组，差异有统计学意义(见图2)。

注：1、2、3、4、为ARM组；5、6、7、8为对照组。图2 P2Y2、β-actin蛋白定量结果

2.4 qRT-PCR结果 P2Y2 mRNA在ARM组胎鼠直肠末端组织中的相对表达量明显低于正常组，P<0.01(见图3，表2)。

分组 蛋白量mRNA正常组0.42±0.0598.53±52.25ARM组0.23±0.06*49.40±26.49*t-4.64-2.37P 0.00 0.03

注：*与正常组相比，P<0.05。

注：A:扩增曲线 ；B：溶解曲线。图3 qRT-PCR扩增/溶解结果

3 讨论

先天性肛门直肠畸形是世界卫生组织重点监测的先天性畸形，过去人们常常认为ARM患儿术后排便功能障碍与术后巨结肠、巨直肠或直肠无力有关[6]。现有研究表明直肠末端肠神经发育异常是导致ARM患儿术后排便功能障碍的重要原因之一[7]，而肠神经系统发育异常的机制目前仍不十分清楚。肠神经系统是神经元、神经递质和蛋白质构成的一个网状结构，保持神经元之间的信息顺利传递，肠神经系统内的神经元可通过分泌兴奋性神经递质和抑制性神经递质来调节胃肠道功能，神经递质缺失会导致肠神经系统发育异常，导致肠道动力障碍性疾病的发生。

ATP是肠管非肾上腺素能、非胆碱能神经系统(non-adrenergic noncholinergic nerues, NANC)释放的一种抑制性神经递质，是重要的嘌呤突触传递。它和血管活性肠肽(VIP)、一氧化氮(NO)都是胃肠道NANC抑制性神经递质，主要分布于胃肠道及其它各种组织中，对肠神经元细胞的增殖、分化、迁移、修复等活动起重要作用。所以，ATP可作为ENS发育的重要指标之一，但其功能的发挥必须与相应的受体相结合。P2Y2作为其重要受体之一，在胃肠道内分布最为广泛[8]，因此,P2Y2受体的多少可以间接反映肠道ATP神经递质的功能。

目前，国内外的研究表明ATP可通过与P2Y2受体结合促进神经轴突的外向生长。 Arthur等[9]研究发现，ATP激活P2Y2后，引起酪氨酸激酶受体A(TrkA)和P2Y2受体共区域化和联系，增强了神经元的生长、分化、移行等过程。Thornton等[10]发现在小鼠回肠内引起的慢兴奋性突触后电位被P2Y受体拮抗剂阻断后，随即出现在NOS(一氧化氮合酶)阳性的下行神经元，研究提示P2Y参与下行传导。也有学者研究发现豚鼠肌间和黏膜下神经丛P2Y2表达的部位也有NOS表达[11]，没有P2Y2表达的区域也没有NOS的表达，这些研究表明同为肠神经系统的抑制性神经递质，ATP可能与NOS存在着相似的功能。此后，Donnell等[12]在先天性巨结肠的研究中发现P2Y2在先天性巨结肠肠壁内有表达，并且在病变肠管中表达量较正常肠管明显减少，推测P2Y2受体缺乏可导致肠管的松弛功能障碍，从而使肠管处于持续痉挛状态。但对于ATP及其受体P2Y2在ARM直肠末端内的表达及其作用，目前尚未见报道。

本实验通过观察P2Y2在ARM胎鼠直肠末端的表达情况，发现P2Y2在直肠末端黏膜下及肌间神经丛胞质中有表达，在正常组呈强阳性反应，而在ARM组呈弱阳性反应，ARM组直肠末端黏膜下及肌间神经元细胞的数目明显少于正常组，说明了ETU成功诱导ARM胎鼠的发生。Western blot及qRT-PCR结果显示P2Y2蛋白及mRNA量在ARM组中的表达较正常组明显降低，推测ARM患儿术后便秘的发生可能是P2Y2表达下调、影响与ATP神经递质的结合，从而干扰其功能的发挥，导致直肠末端肠管的松弛作用功能发生障碍，使肠管处于持续性痉挛状态，这表明P2Y2可能参与并影响ARM胎鼠直肠末端肠神经系统的发育。本实验仅研究了P2Y2受体在ARM胎鼠直肠未端的表达，未对ATP神经递质进行检测。对于ATP的表达是否也存在异常以及两者之间的联系将是本课题组进一步研究的方向。

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