双溴代马蹄金素衍生物的合成及其抗HBV活性

梁光平，胡占兴，黄正明，刘青川，张建新，梁光义，徐必学

(1.贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室，贵州 贵阳 550002；2.贵阳中医学院 药学院，贵州 贵阳 550002；3.中国人民解放军第302医院 药学部，北京 丰台 100039)

乙肝是由乙肝病毒(Hepatitis B virus, HBV)感染引起的，全球估计有20亿人感染乙肝病毒，约有4亿人患有慢性肝脏感染疾病，绝大部分人群分布在亚太地区[1]。全球每年有上百万人死于乙肝病毒感染的相关疾病[2-3]，以拉米夫定为代表的核苷类药物和以干扰素-α为代表的生物类免疫调节剂等主流药物均存在不良反应、耐药以及价格昂贵等缺陷。因此，寻找和开发新的抗乙肝病毒药物具有重要的意义[4]。

马蹄金素[N-(N-苯甲酰基-L-苯丙氨酰基)-O-乙酰基-L-苯丙氨醇，MTS]是本研究组从马蹄金(DichondrarepensForst.)中分离到的化合物，具有较好的抗HBV活性(见图1)，查阅资料发现该化合物是新化学骨架类型的抗乙肝病毒化合物。对其进行结构修饰得到一系列衍生物，体外抗HBV活性测试发现其中有一些化合物具有较好的抗乙肝病毒活性[5-8]。而含溴的化合物在抗病毒方面具有良好的抑制活性[9-10]，本文以马蹄金素为先导化合物，设计合成具有双溴取代的马蹄金素类似物，并对其进行初步的体外抗HBV活性测试，以期在拓宽马蹄金素结构修饰产物类型的同时，获得更多具有深入研究价值的修饰产物。

1 仪器与试剂

核磁共振谱以TMS为内标，用Inova-400 MHz型超导核磁共振仪(美国Varian公司)测定。质谱用HP-5793质谱仪测定(美国Hewlett-Packard公司)。柱色谱用硅胶(300～400目)为青岛海洋化工厂产品。其余试剂均为市售分析纯或化学纯产品，除特别说明外，未经处理直接使用。6,8-二溴-L-酪氨酸(化学纯，BDH试剂)、L-苯丙氨醇(纯度99%，扬州宝盛生物化工有限公司)和L-苯丙氨酸甲酯(纯度99%，扬州宝盛生物化工有限公司)。

2 实验内容

2.1 目标化合物的合成路线 合成路线如图2所示，以6,8-二溴-L-酪氨酸为起始原料，在SOCl2以及CH3OH的作用下得化合物1；化合物1与苯甲酸在氯甲酸异丁酯(IBCF)和N-甲基吗啉(NMM)的作用下反应得到化合物2，再经碱水解得化合物3，在IBCF-NMM存在下，化合物3与L-苯丙氨醇缩合得化合物4，化合物3与L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐反应得化合物6，化合物4经取代反应得化合物5a～5e，化合物6经取代反应后得化合物7a～7d。

图1 马蹄金素的化学结构

图2 目标化合物的合成路线

试剂及反应条件: (a) MeOH, SOCl2, rt, 2.5 h, then reflux for 30 min; (b) benzoic acid, IBCF, NMM, CH2Cl2, DMF, -5oC to rt, 8 h; (c) NaOH, DMF, rt, 1 h; (d) L-phenylalanol, IBCF, NMM, CH2Cl2, DMF, -5oC to rt, 8 h; (e) 1-Iodooctane or 1-bromohexane or 1-iodo-2-methylpropane or iodoethane, 1,4-dioxane, K2CO3, rt; (f) L-phenylalanine methyl ester hydrochloride, CH2Cl2, DMF, IBCF, NMM, -5oC to rt, 8 h; (g) 2-Dimethylaminoethyl chloride hydrochloride or 1-bromopentane or 1-iodooctane or 1-bromohexane or ethyl chloroacetate, DMF, K2CO3, rt。

2.2 化学合成 6,8-二溴-L-酪氨酸甲酯盐酸盐①N-苯甲酰基-6,8-二溴-L-酪氨酸甲酯②和N-苯甲酰基-6,8-二溴-L-酪氨酸③的合成根据参考文献[5]的方法即可合成，3步反应总收率为60%左右。

N-(N-苯甲酰基-6,8-二溴-L-酪氨酰基)-L-苯丙氨醇(4)的合成：取化合物3(6.65 g，15.0 mmol)，L-苯丙氨醇(2.72 g，18.0 mmol)于反应瓶中，65℃真空干燥1 h后，在氩气保护下，加入经分子筛干燥的DMF(50 mL)和CH2Cl2(100 mL)溶解完全，加入NMM(3.9 mL，34.5 mmol)，冰盐浴冷却下，缓慢滴加含IBCF(2.4 mL，18.0 mmol)的CH2Cl2溶液20 mL。滴毕，继续搅拌，TLC跟踪反应，约8 h反应完全，加少量水终止反应，减压回收CH2Cl2，用乙酸乙酯(500 mL×2)萃取，有机层依次以水、稀盐酸、饱和NaHCO3溶液洗涤，无水MgSO4干燥，减压回收乙酸乙酯至有大量固体析出，冷却过滤，滤饼干燥即得化合物4(7.2 g，产率83%)。m.p. 234～236℃;ESI-MSm/z: 577.1 [M+H]+;1H-NMR (DMSO-d6) δ: 9.22 (s, 1H, 7-OH), 8.54 (d,J= 7.6 Hz, 1H, 1′′-CONH), 8.47 (d,J= 8.8 Hz, 1H, 1-CONH), 7.75 (d,J= 7.0 Hz, 2H, H-3′′, 7′′), 7.51 (m, 3H, H-4′′-6′′), 7.44 (m, 2H, H-6′, 8′), 7.26-7.17 (m, 5H, H-5, 9, 5′, 7′, 9′), 4.84 (t,J= 5.2 Hz, 1H, 1′-OH), 4.65 (m, 1H, H-2), 4.49 (m, 1H, H-2′), 3.20 (m, 2H, H-3), 2.95 (m, 2H, H-3′);13C-NMR (DMSO-d6) δ: 171.9, 171.4, 166.5, 149.1, 137.0, 134.0, 133.0, 132.9, 131.5, 129.2, 128.4, 128.3, 127.4, 126.7, 111.6, 62.2, 54.5, 53.8, 36.7, 35.5. Anal. calcd for C25H24Br2N2O4:C 52.10, H 4.20, N 4.86; found C 52.09, H 4.21, N 4.84。

N-(N-苯甲酰基-O-二甲氨基乙基-6,8-二溴-L-酪氨酰基)-L-苯丙氨醇(5a)的合成：取化合物4(200 mg，0.35 mmol)、无水K2CO3(290 mg，2.1 mmol)和二甲氨基氯乙烷盐酸盐(60 mg，21.08 mmol)置于反应瓶中，加入1,4-二氧六环70 mL，再加入碳酸钾质量10%的水，100～105℃油浴中回流3.5 h使之反应完毕(TLC检测)。反应液冷却至室温，加入乙酸乙酯(200 mL)和水(100 mL)萃取，乙酸乙酯层用0.1 mol/L盐酸反萃取，取酸水层，以0.2 mol/L的NaOH水溶液调pH 8～9，加入乙酸乙酯(200 mL)萃取，有机层经水洗一次，无水MgSO4干燥，回收溶剂至干，残留物经硅胶柱层析(氯仿︰甲醇，25︰1)得化合物5a(162 mg，收率为72%)。m.p. 218～221°C; ESI-MSm/z: 648.2 [M+H]+;1H-NMR (DMSO-d6) δ: 8.51 (d,J= 8.8 Hz, 1H, 1′′-CONH), 7.94 (d,J= 8.4 Hz, 1H, 1-CONH), 7.80 (d,J= 7.2 Hz, 2H, H-3′′, 7′′), 7.64 (s, 2H, H-5, 9), 7.55-7.44 (m, 3H, H-6′-8′), 7.24-7.12 (m, 5H, H-4′′-6′′, 5′, 9′), 4.83 (m, 1H, H-2), 4.70-4.63 (m, 1H, H-2′), 3.95 (t,J= 6.0 Hz, 1H, -OH), 3.90 (m, 2H, 7-OCH2CH2N), 3.37-3.31 (m, 4H, H-3, 1′), 3.01 (m, 1H, H-3′a), 2.94-2.85 (m, 2H, 7-OCH2CH2N), 2.70-2.65 (m, 1H, H-3′b), 2.21 (s, 6H, -N(CH3)2);13C-NMR (DMSO-d6) δ: 170.4, 166.3, 150.9, 138.9, 137.8, 134.0, 133.5, 131.3, 129.1, 128.2, 128.0, 127.3, 125.9, 117.0, 71.2, 62.1, 58.1, 54.5, 52.5, 45.4, 36.4, 35.9. Anal. calcd for C29H33Br2N3O4: C 53.80, H 5.14, N 6.49; found C 53.47, H 5.28, N 6.52。

N-(N-苯甲酰基-O-正戊基-6,8-二溴-L-酪氨酰基)-L-苯丙氨醇(5b)的合成：取化合物4 (150 mg, 0.26 mmol)和无水K2CO3(290 mg, 0.21 mmol)置于反应瓶中, 依次加入DMF(10 mL)，溴代正戊烷(1.30 mmol)，所得混合物于50 ℃油浴中搅拌4.5 h至反应完毕(TLC检测)。待反应液冷却至室温后, 加入乙酸乙酯(200 mL)和水(100 mL)萃取，有机层经水洗，无水MgSO4干燥，浓缩，残留物经硅胶柱层析(石油醚∶乙酸乙酯，4∶1)得85 mg白色固体5b，产率为50%。m.p. 207～210 °C; ESI-MSm/z: 669.4 [M+Na]+;1H-NMR (CDCl3) δ: 8.50 (d,J=8.4 Hz, 1H, 1′′-CONH), 7.97 (d,J= 8.4 Hz, 1H, 1-CONH), 7.80 (d,J= 7.2 Hz, 2H, H-3′′, 7′′), 7.64 (s, 2H, H-5, 9), 7.54 (m, 1H, H-7′), 7.46 (m, 2H, H-6′, 8′), 7.24-7.14 (m, 5H, H-4′′-6′′, 5′, 9′), 4.84 (m, 1H, H-2), 4.66 (m, 1H, H-2′), 3.89 (m, 3H, 1′-OH, 7-OCH2(CH2)3CH3), 3.32 (m, 2H, H-1′), 3.04-2.87 (m, 3H, H-3, 3′a), 2.66 (m, 1H, H-3′b), 1.76 (m, 2H, 7-OCH2CH2(CH2)2CH3), 1.46(m, 2H, 7-O(CH2)2CH2CH2CH3), 1.28 (m, 2H, 7-O(CH2)3CH2CH3), 0.91 (t,J= 7.0 Hz, 3H, 7-O(CH2)5CH3);13C-NMR (CDCl3) δ: 170.4, 166.2, 150.9, 139.0, 137.8, 134.0, 133.4, 131.3, 129.0, 128.2, 128.0, 127.3, 125.9, 117.0, 67.3, 62.1, 54.5, 52.5, 36.4, 35.9, 29.4, 25.7, 22.0, 14.0. Anal. calcd for C30H34Br2N2O4: C 55.74, H 5.30, N 4.33; found C 55.75, H 5.27, N 4.34。

N-(N-苯甲酰基-O-正辛基-6,8-二溴-L-酪氨酰基)-L-苯丙氨醇(5c)的合成：取化合物4(100 mg)、无水碳酸钾(192 mg,1.4 mmol)、碘代正辛烷(210 mg, 0.9 mmol)，参照化合物5b的制备方法得到72 mg白色粉末，收率为60%。m.p. 233～235 °C; ESI-MSm/z: 689.4 [M+H]+;1H-NMR (CDCl3) δ: 8.53 (d,J= 8.4 Hz, 1H, 1′′-CONH), 7.97 (d,J= 8.0 Hz, 1H, 1-CONH), 7.80 (d,J= 7.2 Hz, 2H, H-3′′, 7′′), 7.65 (s, 2H, H-5, 9), 7.53 (m, 1H, H-7′), 7.46 (m, 2H, H-6′, 8′), 7.24-7.18 (m, 4H, H-4′′, 6′′, 5′, 9′), 7.14 (m, 1H, H-5′′), 4.84 (t,J= 5.2 Hz, 1H, 1′-OH), 4.65 (m, 1H, H-2), 3.91 (m, 1H, H-2′), 3.87 (d,J= 6.4 Hz, 2H, 7-OCH2(CH3)6CH3), 3.35-3.28 (m, 2H, H-1′), 3.03-2.85 (m, 3H, H-3, 3′a), 2.67 (m, 1H, H-3′b), 1.72 (m, 2H, 7-OCH2CH2(CH2)5CH3), 1.44 (m, 2H, 7-O(CH2)2CH2(CH2)4CH3), 1.26 (m, 8H, 7-O(CH2)3(CH2)4CH3), 0.85 (t,J= 6.8 Hz, 3H, 7-O(CH2)7CH3);13C-NMR (CDCl3) δ: 170.4, 166.3, 150.9, 138.8, 137.7, 134.0, 133.5, 131.3, 129.1, 128.1, 128.0, 127.3, 125.8, 117.0, 73.0, 62.1, 54.4, 52.5, 36.4, 35.9, 31.2, 29.4, 28.7, 28.5, 25.3, 22.0, 13.9. Anal. calcd for C33H40Br2N2O4: C 57.57, H 5.86, N 4.07; found C 57.55, H 5.85, N 4.10。

N-(N-苯甲酰基-O-正己基-6,8-二溴-L-酪氨酰基)-L-苯丙氨醇(5d)的合成：取化合物4(100 mg)、无水碳酸钾(192 mg, 1.4 mmol)、溴代正己烷(143 mg, 0.9 mmol)，参照化合物5b的制备方法得到75 mg白色粉末，收率为65%。m.p. 229～232 °C; ESI-MSm/z: 661.4 [M+H]+;1H-NMR (CDCl3) δ: 8.52 (d,J= 8.8 Hz, 1H, 1′′-CONH), 7.96 (d,J= 8.4 Hz, 1H, 1-CONH), 7.80 (d,J= 7.2 Hz, 2H, H-3′′, 7′′), 7.64 (s, 2H, H-5, 9), 7.54 (m, 1H, H-7′), 7.46 (m, 2H, H-6′, 8′), 7.24-7.14 (m, 5H, H-4′′-6′′, 5′, 9′), 4.84 (m, 1H, H-2), 4.66 (m, 1H, H-2′), 3.91-3.85 (m, 3H, 1′-OH, 7-OCH2(CH2)4CH3), 3.37-3.28 (m, 2H, H-1′), 3.02-2.85 (m, 3H, H-3, 3′a), 2.66 (m, 1H, H-3′b), 1.74 (m, 2H, 7-OCH2CH2(CH2)3CH3), 1.44 (m, 2H, 7-O(CH2)2CH2(CH2)2CH3), 1.29 (m, 4H, 7-O(CH2)3(CH2)2CH3), 0.87 (t,J= 6.8 Hz, 3H, 7-O(CH2)5CH3);13C-NMR (CDCl3) δ: 170.4, 166.3, 150.9, 138.9, 137.8, 134.0, 133.5, 131.3, 129.1, 128.2, 128.0, 127.3, 125.9, 117.0, 73.0, 62.1, 54.5, 52.5, 36.4, 35.9, 31.0, 29.4, 24.9, 22.0, 13.9. Anal. calcd for C31H36Br2N2O4: C 56.38, H 5.49, N 4.24; found C 56.09, H 5.84, N 4.64。

N-(N-苯甲酰基-O-乙酸乙酯基-6,8-二溴-L-酪氨酰基)-L-苯丙氨醇(5e)的合成：取化合物4(100 mg)、无水碳酸钾(192 mg, 1.4 mmol)、氯乙酸乙酯(106 mg, 0.9 mmol)，参照化合物5b的制备方法得到47 mg白色粉末，收率为41%。m.p. 155～157°C; ESI-MSm/z: 663.2 [M+H]+;1H-NMR (CDCl3) δ: 8.53 (d,J= 8.4 Hz, 1H, 1′′-CONH), 7.96 (d,J= 8.4 Hz, 1H, 1-CONH), 7.81 (d,J= 7.2 Hz, 2H, H-3′′, 7′′), 7.64 (s, 2H, H-5, 9), 7.54 (m, 1H, H-7′), 7.46 (m, 2H, H-6′, 8′), 7.24-7.14 (m, 5H, H-4′′-6′′, 5′, 9′), 4.86 (t,J= 5.0 Hz, 1H, 1′-OH), 4.68 (m, 2H, H-2, 2′), 4.42 (s, 2H, 7-OCH2COOCH2CH3), 3.94 (m, 2H, 7-OCH2COOCH2CH3), 3.32 (m, 2H, H-1′), 3.04-2.87 (m, 3H, H-3, 3′a), 2.66 (m, 1H, H-3′b), 1.28 (t,J= 6.8 Hz, 3H, 7-OCH2COOCH2CH3);13C-NMR (CDCl3) δ: 171.4, 170.2, 166.1, 150.9, 139.0, 137.9, 134.1, 133.4, 131.3, 129.0, 128.2, 128.0, 127.3, 125.7, 118.3, 70.1, 66.9, 62.5, 54.9, 52.5, 36.9, 35.9, 14.1. Anal. calcd for C29H30Br2N2O6: C 52.59, H 4.57, N 4.23; found C 52.25, H 4.54, N 4.04。

N-(N-苯甲酰基-6,8-二溴-L-酪氨酰基)-L-苯丙氨酸甲酯(6)的合成：取化合物3(4.43 g，10.0 mmol)，L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐(2.59 g，12.0 mmol)，NMM(2.6 mL，23.0 mmol)，IBCF(1.6 mL，12.0 mmol)，按化合物4的合成方法进行，得化合物6(4.9 g，产率81.1%)。m.p. 218～219°C; ESI-MSm/z: 627.0 [M+Na]+;1H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ: 8.55 (d,J= 7.6 Hz, 1H, 1′′-CONH), 8.47 (d,J= 8.8 Hz, 1H, 1-CONH), 7.75 (d,J= 6.8 Hz, 2H, H-3′′, 7′′), 7.51 (m, 3H, H-4′′-6′′), 7.44 (m, 2H, H-6′, 8′), 7.26-7.17 (m, 5H, H-5, 9, 5′, 7′, 9′), 4.65 (m, 1H, H-2), 4.49 (m, 1H, H-2′), 3.58 (s, 3H, 1′-OCH3), 3.20 (m, 2H, H-3), 2.95 (m, 2H, H-3′);13C-NMR (DMSO-d6) δ: 171.9, 171.4, 166.5, 149.1, 137.0, 134.0, 133.0, 132.9, 131.5, 129.2, 128.4, 128.3, 127.4, 126.7, 111.6, 54.5, 53.8, 52.0, 36.7, 35.5. Anal. calcd for C26H24Br2N2O5: C 51.68, H 4.00, N 4.64; found C 51.65, H 4.01, N 4.63。

N-(N-苯甲酰基-O-正辛基-6,8-二溴-L-酪氨酰基)-L-苯丙氨酸甲酯(7a)的合成：取化合物6(100 mg)、无水碳酸钾(183 mg, 1.3 mmol)、碘代正辛烷(200 mg, 1.3 mmol)，参照化合物7a的制备方法得到79 mg白色粉末，收率为67%。m.p. 177～179°C; ESI-MSm/z: 739.2 [M+Na]+;1H-NMR (DMSO-d6) δ: 8.55-8.51 (m, 2H, 1-CONH, 1′′-CONH), 7.76-7.74 (m, 2H, H-3′′, 7′′), 7.64 (s, 2H, H-5, 9), 7.53-7.49 (m, 1H, H-7′), 7.45-7.41 (m, 2H, H-6′, 8′), 7.26-7.16 (m, 5H, H-4′′-6′′, 5′, 9′), 4.73-4.67 (m, 1H, H-2), 4.54-4.48 (m, 1H, H-2′), 3.84 (m, 2H, 7-OCH2(CH2)6CH3), 3.58 (s, 3H, 1′-OCH3), 3.07-2.84 (m, 4H, H-3, 3′), 1.74-1.67 (m, 2H, 7-OCH2CH2(CH2)6CH3), 1.45-1.37 (m, 2H, 7-O(CH2)2CH2(CH2)4CH3), 1.26-1.22 (m, 8H, 7-O(CH2)3(CH2)4CH3), 0.87-0.81 (m, 3H, 7-OCH2(CH2)6CH3);13C-NMR (DMSO-d6) δ: 171.9, 171.3, 166.6, 151.1, 137.7, 137.0, 134.0, 133.6, 131.5, 129.2, 128.4, 128.3, 127.5, 126.7, 117.2, 73.1, 54.3, 53.8, 52.0, 36.8, 35.7, 31.3, 29.5, 28.8, 28.7, 25.4, 22.2, 14.1. Anal. calcd for C34H40Br2N2O5: C 56.99, H 5.63, N 3.91; found C 57.45, H 5.65, N 4.03。

N-(N-苯甲酰基-O-正己基-6,8-二溴-L-酪氨酰基)-L-苯丙氨酸甲酯(7b)的合成：取化合物6(100 mg)、无水碳酸钾(183 mg, 1.3 mmol)、溴代正己烷(137 mg, 0.8 mmol)，参照化合物7b的制备方法得到62 mg白色粉末，收率为54%。m.p. 149～151°C; ESI-MSm/z: 711.2 [M+Na]+;1H-NMR (DMSO-d6) δ:8.55 (m, 2H, 1-CONH, 1′′-CONH), 7.75 (m, 2H, H-3′′, 7′′), 7.64 (s, 2H, H-5, 9), 7.53-7.49 (m, 1H, H-7′), 7.43 (m, 2H, H-6′, 8′), 7.26-7.16 (m, 5H, H-4′′-6′′, 5′, 9′), 4.74-4.68 (m, 1H, H-2), 4.54-4.49 (m, 1H, H-2′), 3.84 (t,J= 6.4 Hz, 2H, 7-OCH2(CH2)4CH3), 3.58 (s, 3H, 1′-OCH3), 3.07-2.84 (m, 4H, H-3, 3′), 1.74-1.67 (m, 2H, 7-OCH2CH2(CH2)3CH3), 1.45-1.38 (m, 2H, 7-O(CH2)2CH2(CH2)2CH3), 1.30-1.25 (m, 4H, 7-O(CH2)3(CH2)2CH3), 0.85 (t,J= 7.2 Hz, 3H, 7-O(CH2)5CH3);13C-NMR (DMSO-d6) δ: 171.8, 171.3, 166.6, 151.1, 137.7, 136.9, 134.0, 133.6, 131.5, 129.2, 128.4, 128.3, 127.4, 126.7, 117.2, 73.2, 54.3, 53.8, 52.0, 36.8, 35.7, 31.1, 29.5, 25.1, 22.1, 14.0. Anal. calcd for C32H36Br2N2O5: C 55.21, H 5.08, N 4.15; found C 55.89, H 5.650, N 4.23。

N-(N-苯甲酰基-O-异丁基-6,8-二溴-L-酪氨酰基)-L-苯丙氨酸甲酯(7c)的合成：取化合物6(100 mg)、无水碳酸钾(183 mg, 1.3 mmol)、碘代异丁烷(152 mg, 0.83 mmol)，参照化合物7c的制备方法得到44 mg白色粉末，收率为40%。m.p. 211-213°C; ESI-MSm/z: 683.2 [M+Na]+;1H-NMR (DMSO-d6) δ: 8.57-8.53 (m, 2H, 1-CONH, 1′′-CONH), 7.77-7.74 (m, 2H, H-3′′, 7′′), 7.65 (s, 2H, H-5, 9), 7.53-7.49 (m, 1H, H-7′), 7.45-7.41 (m, 2H, H-6′, 8′), 7.26-7.16 (m, 5H, H-4′′-6′′, 5′, 9′), 4.73-4.68 (m, 1H, H-2), 5.54-4.48 (m, 1H, H-2′), 3.65 (d,J= 8.4 Hz, 2H, 7-OCH2CH(CH3)2), 3.58 (s, 3H, 1′-OCH3), 3.07-2.84 (m, 4H, H-3, 3′), 2.08-2.00 (m, 1H, 7-OCH2CH(CH3)2), 0.98 (d,J= 6.8 Hz, 6H, 7-OCH2CH(CH3)2);13C-NMR (DMSO-d6) δ: 171.8, 171.2, 166.6, 150.9, 137.6, 136.9, 134.0, 133.6, 131.5, 129.1, 128.3, 127.4, 126.7, 117.1, 78.9, 54.2, 53.8, 52.0, 36.7, 35.6, 28.7, 19.1. Anal. calcd for C30H32Br2N2O5: C 54.56, H 4.88, N 4.24; found C 54.37, H 5.19, N 4.47。

N-(N-苯甲酰基-O-乙基-6,8-二溴-L-酪氨酰基)-L-苯丙氨酸甲酯(7d)的合成：取化合物6(100 mg)、无水碳酸钾(183 mg, 1.3 mmol)、碘代正辛烷(129 mg, 0.83 mmol)，参照化合物7d的制备方法得到29 mg白色粉末，收率为28%。m.p. 185～188°C; ESI-MSm/z: 655.2 [M+Na]+;1H-NMR (DMSO-d6) δ: 8.54 (m, 2H, 1′′-CONH, 1-CONH), 7.76 (m, 2H, H-3′′, 7′′), 7.65 (s, 2H, H-5, 9), 7.50 (t,J= 7.6 Hz, 1H, H-7′), 7.44 (m, 2H, H-6′, 8′), 7.24-7.19 (m, 5H, H-4′′-6′′, 5′, 9′), 4.71 (m, 1H, H-2), 4.52 (m, 1H, H-2′), 3.93 (m, 2H, 7-OCH2CH3), 3.34 (s, 3H, 1′-COOCH3), 3.04-2.99 (m, 3H, H-3, 3′a), 2.89 (dd,J1= 2.0,J2= 11.2 Hz, 1H, H-3′b), 1.33 (t,J= 7.0 Hz, 3H, 7-OCH2CH3);13C-NMR (DMSO-d6) δ: 171.7, 171.1, 166.4, 151.0, 137.6, 136.9, 133.9, 133.5, 131.4, 129.1, 128.3, 128.2, 127.3, 126.6, 117.1, 69.1, 54.1, 53.7, 51.9, 36.7, 35.6, 15.3. Anal. calcd for C28H28Br2N2O5:C 53.18, H 4.46, N 4.43; found C 52.98, H 4.51, N,4.47。

2.3 体外抗HBV活性筛选 HepG22.2.15细胞每毫升20万个接种24孔细胞培养板，每孔500 μL，贴壁1 d后给药，每孔0.7 mL药液，样品共设20 μg·mL-1、8 μg·mL-1、3.2 μg·mL-1等3个浓度，每浓度3孔，以加等量DMSO的培养液代替药液的细胞为对照组，以8 μg·mL-1的拉米夫定为阳性对照。每3d换原浓度药液培养，6d后提取HBV DNA，经荧光定量PCR测定其DNA含量，根据测定结果计算样品对HepG2 2.2.15细胞DNA复制的抑制率[11]，结果(见表1)。

表1目标化合物对HepG2 2.2.15细胞DNA复制的抑制率

编号抑制率(%)20(μg·mL-1)8(μg·mL-1)3.2(μg·mL-1)5a89.8131.7823.345b-41.27-38.1330.995c23.4644.8033.295d14.8848.8332.035e-37.12-8.8820.227a6.2334.5012.877b42.3237.3440.357c-7.4938.363.507d-11.83-10.6910.12 拉米夫定97.74

3 结果

通过化学方法合成了11个未见报道的马蹄金素双溴取代的衍生物，并对9个目标产物进行体外抗HBV活性筛选，结果显示，化合物5a、5c、5d、7b具有较好的抑制活性，其抑制率分别为89.81% (20 μg·mL-1)、44.80% (8 μg·mL-1)、48.83% (8 μg·mL-1)、42.32% (20 μg·mL-1)。

4 讨论

本研究合成了11个马蹄金素类似物，在制备化合物5a时，以1,4-二氧六环作为溶剂，外加无水碳酸钾质量10 %的水，所得产物的收率以及反应速率均比DMF作为溶剂的效果好，但以1,4-二氧六环作溶剂时，若没有加适量的水，则反应不发生。此外，还测定了9个衍生物的体外抗HBV活性，结果表明，所有化合物在低浓度时均有不同程度的抑制活性，当浓度增加以后，部分化合物显示出促进细胞生长的活性。化合物5a在20 μg·mL-1的浓度下具有较高的抑制率，达到89.81%，接近于拉米夫定的抑制率，该化合物具有进一步研究开发的价值。

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