壬基酚对仔鼠脑皮质增殖细胞核抗原表达的影响

张 恒，俞 捷，岳 欢，罗 娅，李克彬，杨雪松，封校亚，许 洁

(1.遵义市第一人民医院 病理科，贵州 遵义 563002； 2.遵义医学院 公共卫生学院，贵州 遵义 563099；3.遵义市第一人民医院 检验科，贵州 遵义 563002)

壬基酚(Nonylphenol, NP)是公认的对机体具有毒性作用的环境雌激素，本课题组前期研究发现,NP孕期暴露可影响仔鼠的神经发射和学习记忆能力降低[1-3]，NP所致神经毒性的机制目前尚不清楚。

增殖细胞核抗原(proliferating-cel nuclear antigen,PCNA)是定位于细胞核内的DNA修复相关蛋白，其表达的增强表明细胞正处在损伤修复或增生状态[4]。本研究通过建立孕哺期暴露NP的仔鼠模型，观察仔鼠断乳期(21d)，儿童期(60d)脑组织皮质部神经元细胞PCNA的表达，并判断NP暴露剂量与PCNA蛋白表达的相关性，初步探讨NP引起认知功能障碍的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物分组及处理 清洁级SD大鼠60只(动物合格证号：SCXK(渝)20070005)，分为对照组、低、中、高剂量组(壬基酚50、100、200毫克/公斤/天组)，母鼠受孕第6天到出生后21 d染毒壬基酚。于仔鼠出生21 d、60 d取大脑皮质组织制片检查。

1.1.2 试剂 NP纯度99%(东京化成株试会社)，一抗PCNA (北京中山生物试剂制品有限公司)；兔抗鼠PCNA多克隆抗体(北京中山生物试剂制品有限公司)；二抗羊抗兔(北京中杉金桥生物科技有限公司)；DAB显色试剂盒(DAKO公司)。

1.1.3 实验器材 电热恒温水浴箱(北京市永光明医疗仪器厂)；101-2型电热干燥箱(上海路达实验仪器有限公司)；SZ-93双蒸水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂)；AL-104电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司);普通光学/荧光显微成像系统(德国徕卡公司)。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化步骤 10%中性福尔马林固定，常规石蜡包埋、切片；二甲苯脱蜡；梯度酒精涮洗;蒸馏水冲洗；3%H202侵泡；柠檬酸盐高压修复；滴加30 μL动物封闭血清液；滴加anti-PCNA一抗(1∶100)25 μL，4 ℃孵育过夜；滴加生物素标记羊抗兔IgG；DAB显色液显色，自来水冲洗以终止显色；苏木素复染；梯度酒精涮洗；中性树脂胶封片。

1.2.2 免疫组化图象分析及判断 每组内每张大鼠脑切片在皮质随机挑选3个400倍视野进行拍照。阳性部位定位于细胞核，其染色强度通过测量累积光密度值(Integral optical density，IOD)，IOD值越大，阳性表达越强。

1.3 统计学分析 采用单因素方差分析做差异比较，有差异者做q检验进行两两比较，相关分析采用pearson相关。

2 结果

2.1 PCNA蛋白表达的变化 各暴露组与对照组比较，仔鼠21、60 d皮质部神经细胞PCNA阳性细胞数较多。高剂量组与中、低剂量组比较，PCNA阳性细胞数较多。随着给药剂量和给药时间的增加，PCNA阳性细胞数目逐渐增多。60 d各剂量组脑组织与21 d比较，PCNA阳性细胞数较多，强度增加。结果(见图1～2)。

注：A、B、C、D分别代表对照组和低、中、高剂量组。 图1 21 d仔鼠皮质PCNA蛋白表达(×400)

注：A、B、C、D分别代表对照组和低、中、高剂量组。 图2 60 d仔鼠皮质PCNA蛋白表达(×400)

2.2 图像分析数据显示，孕鼠NP暴露后，与对照组比较，低、中、高剂量组21、60d PCNA阳性细胞数明显增多(F=476.34、1077.55，P<0.01)，光密度增高(F=44.46、7.58，P<0.01)随着给药剂量和给药时间的增加，PCNA阳性细胞数目逐渐增多，21、60d阳性细胞数与NP暴露剂量呈正相关(r=0.873、0.606，P<0.05)，结果(见表1)。

表1仔鼠皮质PCNA阳性细胞数和灰度值差异比较

分组阳性细胞数21 d60 d灰度值21d60dC13.00±1.7712.25±3.01890362±261664 835730±133069 L29.12±3.44*79.87±3.48* 3791396±1448685*9537855±3853205 M56.62±3.62*98.87±4.48*10464333±4772021* 15413988±13291670*H78.12±5.64*119.75±4.80*15749976±2687923*17343043±6353555*F445.901077.5544.467.58P0.000.000.000.00

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

3 讨论

增殖细胞核抗原(proliferating-cel nuclear antigen,PCNA)是一种重要的定位于细胞核内的DNA修复相关蛋白，参与了多种DNA修复过程，如DNA的正常复制、碱基切除、核苷酸切除及错配切除等过程，故PCNA表达的增强或增多表明细胞正处在损伤修复和、或增生状态，是一种可靠、稳定的细胞增殖、修复标记物[5]。NP引起皮质细胞阳性表达升高还是降低，这种变化在一定程度上可反映中枢神经系统的功能变化。

幼年大鼠处于生长发育旺盛期，其脑皮质内存在一定数量的增殖细胞,这些细胞可能是神经前体细胞，而成熟的神经细胞则无增殖能力[6]。60 d的仔鼠逐渐进入成熟期，随着仔鼠脑组织神经元的发育成熟，成熟的神经元的比例相对21 d的仔鼠(幼年期)应该比较高，PCNA阳性细胞的数量和累计光密度应该略少于21 d，对照组的实验结果证实了这种趋势(成熟的神经细胞无增殖能力，不表达PCNA)，与文献报道的一致。

对于暴露组，21 d和60 d，随着给药剂量和给药时间的增加，PCNA阳性细胞数目逐渐增多，与NP暴露剂量呈正相关。本实验结果显示大鼠孕期NP暴露后，致仔鼠较多的皮质细胞处在增生状态，推测可能是NP对脑组织损伤的修复反应。皮质部细胞由神经元和神经胶质细胞两大类组成，其中90%的细胞是胶质细胞。对于数量占大多数的胶质细胞，PCNA阳性细胞数目与NP暴露剂量和时间呈正相关。暴露NP导致较多胶质细胞处于增殖状态。对于神经元，NP可能影响了神经前体细胞向成熟的神经元的发育，PCNA在非增殖细胞中的表达代表其参与了DNA修复[7]，即这些PCNA阳性表达的神经细胞处于增生状态。NP的毒性作用对机体神经细胞造成了损伤，随后可能启动了损伤修复或增生过程，神经元反应性增殖，并可进一步诱导胶质细胞的增生。尤其对于暴露组60d的仔鼠，进入成熟期皮质本应以PCNA阴性的成熟细胞为主，但在NP的作用下皮质细胞广泛表达PCNA，证明其明显处于增殖状态，可能与机体的损伤修复反应有关，间接反映了NP持续的神经毒性作用。

[参考文献]

[1] Jie X, Jianmei L, Zheng F,et al. Neurotoxic effects of nonylphenol: a review[J]. Wien Klin Wochenschr,2013, 125(3-4):61-70.

[2]许洁，汪洋，张镖，等.壬基酚对子代大鼠皮质部神经生长相关蛋白的影晌，遵义医学院学报，2014，37(1)：77-81.

[3]许洁，汪洋，杨孟雪，等.孕哺期暴露NP对子代大鼠脑组织基因表达谱的影响，遵义医学院学报，2014,37(2)：25-28.

[4]何应学，王亚军，方晓丽.子午流注纳甲法对局灶性脑缺血模型大鼠大脑皮质PCNA表达的影响[J]．甘肃中医学院学报，2012，29(4):5-8.

[5]Giovanni M, Ulrich H. Proliferating cell nuclear antigen (PCNA): a dancer with many partners: a review[J]. Cell Sci，2003,116(3):3051-3060.

[6]王树兴，顾怀宇，黄韧，等．增殖细胞核抗原阳性细胞在幼年大鼠前脑的分布[J]．解剖学研究，2001，23(3):214-216．

[7]丁念，张觉人．填髓益脑法对大鼠脑缺血再灌注增殖细胞核抗原表达的实验研究[J]．中国中医急症，2009，18(8):1301-1314．