胡桃醌对宫颈癌caski细胞的细胞毒作用的研究

吴亚猛，张琳娜，陈思瑶，韩景春，那文婷，张 巍 (吉林医药学院：.临床医学院,2.生化教研室，吉林 吉林 3203)

宫颈癌每年的新发病例平均在13万例以上，在世界的年发病总数中，中国占到1/3到1/4之间，而且现在中国宫颈癌患者的年轻化趋势越来越明显[1]。肿瘤细胞增殖的研究是评价化疗药效的一个重要指标[2]。胡桃醌(juglone,nuein)又名5-羟基-1,4-奈醌，是从胡桃楸新鲜根皮、枝条、青果皮中分离出来的羟基奈醌类化合物，是胡桃楸中的主要毒性物质[3]。为黄色针状结晶，其熔点为155 ℃，微溶于热水，易溶于氯仿和苯，溶于乙醇和乙醚，溶于碱性水溶液呈紫红色，有升华性，具有抗肿瘤的活性，在体外对多种肿瘤细胞具有细胞毒作用，可诱导凋亡，国内外有很多关于胡桃醌抗肿瘤的报道[4]。本实验选用宫颈鳞癌caski细胞作为研究对象，探究胡桃醌对宫颈鳞癌的细胞毒作用，为胡桃醌的细胞毒作用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

caski细胞吉林大学药理教研室赠予；胡桃醌购自sigma公司；酶标仪为BIO-BAD公司的MODEL 550型；LXJ-Ⅱ型离心沉淀机(上海医用分析仪厂)；H110D电子分析天平(美国Sartorius)，倒置显微镜(上海医用分析仪厂)。

1.2 细胞培养

caski细胞培养在含10%新生小牛血清的完全培养液中培养于37 ℃、5%的CO2培养箱中，细胞呈贴壁状态生长，在倒置显微镜下观察细胞生长状况并拍照,适量时进行细胞传代。

1.3 MTT比色法测胡桃醌的抑制率

取对数生长期的caski细胞，调细胞悬液密度为1×104个/mL,按100 μL/每孔接种于96孔培养板。并用胡桃醌与完全培养液配制成20、40、60、80、100 μmol/L不同的浓度培养，设置不加药的对照组和不加MTT的空白对照组，复孔数为3。待细胞贴壁后弃去培养液，给药后培养24 h，期间在倒置显微镜下密切注意观察细胞生长状态并拍照。24 h后每孔加入20 μL MTT,37 ℃孵育4 h[5-6]，弃去上清后每孔加150 μL DMSO(二甲基亚砜)，在摇床上低速振荡10 min，酶标仪490 nm波长测得吸光度值并记录结果。利用公式计算抑制率：抑制率=[1-(实验组吸光度值-空白组吸光度值)/(对照组吸光度值-空白组吸光度值)]×100%。

1.4 统计分析

对全部数据采用SPSS11.0软件进行分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 倒置显微镜下观察细胞形态变化

胡桃醌对宫颈癌caski细胞生长的抑制作用的形态观察见图1。在显微镜下可见未加胡桃醌细胞生长状态良好，加胡桃醌后在显微镜下观察细胞体积缩小，连接消失，与周围细胞脱离，生长状态极差。

A:对照组；B:20 μmol/L；C:40 μmol/L; D:60 μmol/L E:80 μmol/L；F:100 μmol/L

2.2 胡桃醌对caski细胞增殖的影响

不同浓度胡桃醌处理caski细胞24 h后采用MTT法测得各组吸光度，计算胡桃醌对宫颈癌caski细胞生长的抑制率，结果表明宫颈癌细胞的抑制率对胡桃醌的浓度呈明显剂量相关性，胡桃醌的浓度分别为20 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L、80 μmol/L、100 μmol/L。以空白组做对照，测得各组OD值(见图2)。从图中可看出不同浓度胡桃醌对宫颈癌caski细胞的生长均有抑制作用，各组与对照组比较有显著差异。通过标准曲线可计算出胡桃醌对caski细胞的IC50为77.27 μmol/L。

图 2 不同浓度胡桃醌对caski细胞增殖的影响

*P<0.05,**P<0.01

3 讨 论

胡桃醌是从胡桃楸新鲜根皮、枝条、青果皮中分离出的羟基奈醌类化合物，是胡桃楸中主要的毒性物质，是肽基脯氨酰同分异构酶家族成员的特异性抑制剂[7]。本实验选用细胞形态学及MTT法对其抗增殖及诱导凋亡进行初步的测定，测定出胡桃醌对宫颈癌caski细胞最佳的抑制浓度。倒置显微镜下可见阴性对照组细胞生长状态良好，不同浓度胡桃醌处理后细胞生长受抑制，生长状态差，在显微镜下细胞皱缩，且剂量呈依赖性。以上结果表明胡桃醌对宫颈癌caski细胞的增殖有抑制作用，但其在诱导宫颈癌细胞凋亡的过程中，凋亡相关基因的变化及凋亡信号的产生还有待深入研究，以进一步阐述胡桃醌的作用机理。

参考文献：

[1] 梁东霞,张彦娜.宫颈癌与hpv关系的研究进展[J].实用癌症杂志，2010,25(2)：202-205.

[2] 李 杨.中药抗肿瘤的优势[J].时珍国医国药,2006,17(4):672.

[3] 张 巍，李 妍,吕士杰,等.不同浓度的胡桃醌对宫颈癌Hela细胞的细胞毒作用的研究[J].上海中医药杂志，2012,46(6):101-103.

[4] 赵行宇，杨 森，周丽霞，等.胡桃醌对肝癌HepG2细胞的增殖抑制及诱导凋亡作用[J].吉林大学学报：医学版，2013,39(2)：255-258.

[5] 于玲媛，李 洁.MTT法在抗肿瘤药物对细胞杀伤力测定中的应用[J].哈尔滨师范大学自然科学学报，2006,22(5)：93-95.

[6] 赵嘉惠，张华屏，王春芳.MTT法在检测细胞增殖方面的探讨[J].山西医科大学学报，2007，38(3)：262-263.

[7] Seya T,Shime H,Ebihara T,et al.Pattern recognition receptors of innate immunity and their application to tumor immunotherapy[J].Cancer Sci,2010,101(2):313-320.