肺癌组织Lipocalin-2表达与肺癌预后的关系

马小刚 杨晓光 赵峥

·论著·

肺癌组织Lipocalin-2表达与肺癌预后的关系

马小刚 杨晓光 赵峥

目的探讨肺癌组织脂质运载蛋白-2(Lipocalin-2)表达与基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、肿瘤侵袭转移及预后的关系。方法采用免疫组织化学SP法检测Lipocalin-2、MMP-9在55例肺癌组织及40例正常肺组织的表达，分析其表达与临床病理特征、复发率间的关系。采用Western blot检测Lipocalin-2在肺鳞癌和腺癌组织的表达差异。结果Lipocalin-2、MMP-9在肺癌组织的阳性表达率显著高于正常肺组织，差异有统计学意义(P<0.05)，且Lipocalin-2表达与MMP-9呈显著正相关(r=0.586，P<0.05)。Lipocalin-2阳性表达率随着肿瘤TNM临床分期的增高及淋巴结远处转移而增高。Lipocalin-2高表达者术后3年肺癌复发率显著高于低表达者，差异有统计学意义(P<0.05)。Lipocalin-2在肺腺癌组织的表达高于鳞癌组织，差异有统计学意义(P<0.05)。结论肺癌组织Lipocalin-2的异常高表达参与了肿瘤的侵袭转移过程，可作为预后判断的指标。

肺肿瘤；脂质运载蛋白-2；预后

肺癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，患者预后差，致死率高。脂质运载蛋白-2(Lipocalin-2)是载脂蛋白家族成员之一，其表达水平与细胞凋亡、胰岛素抵抗、代谢综合征及血管病变等多个生理和病理过程有关。研究发现，Lipocalin-2在乳腺癌等上皮细胞肿瘤中表达上调，与肿瘤进展密切相关[1]。本研究采用免疫组织化学SP法检测Lipocalin-2在肺癌组织的表达,旨在探讨Lipocalin-2表达与基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、癌细胞侵袭转移及预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2011年1月至2012年12月我院手术切除的肺癌组织标本55例，均经病理确诊，男39例，女16例；年龄34～76岁，中位年龄53.6岁；患者术前均未接受放疗、化疗和内分泌治疗，临床病理资料完整。病理类型：鳞癌24例，腺癌18例，小细胞癌13例。TNM临床分期参照2002年UICC制定的标准：Ⅰ+Ⅱ期22例，Ⅲ+Ⅳ期33例。55例肺癌患者中有淋巴结转移者35例，无淋巴结转移者20例。另取40例正常肺组织作为对照。2组患者年龄、性别比、体重等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 试剂 兔抗鼠Lipocalin-2多克隆抗体、兔抗人MMP-9多克隆抗体购自Santa Cruz公司。免疫组化SP试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 免疫组化：采用免疫组织化学染色SP法测定Lipocalin-2、MMP-9的表达，严格按照试剂盒说明书操作，用已知阳性切片作为阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照。判定标准：Lipocalin-2、MMP-9阳性染色的判定标准为在细胞质或细胞膜中检出黄色或棕黄色颗粒。随机选取5个有代表性的视野(×400)计数200个细胞，若阳性细胞占同类细胞的百分比≥10%为阳性，<10%为阴性。

1.3.2 Western blot：取冻存肺癌组织及正常肺组织石蜡标本，Western blot 检测Lipocalin-2蛋白表达。提取组织总蛋白，BCA法定量蛋白后进行SDS-聚丙酰胺凝胶电泳，电转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h，特异性一抗4℃孵育过夜，IgG二抗孵育2 h，ECL显色。采用UVP分析软件对目的条带及内参照条带做灰度值分析。

2 结果

2.1 Lipocalin-2、MMP-9蛋白在肺癌及正常肺组织的表达 Lipocalin-2、MMP-9蛋白主要定位于细胞膜和细胞质中，呈线状棕黄色颗粒。在正常肺组织Lipocalin-2仅少量表达(7.5%)，MMP-9不表达，二者在肺癌组织均高表达(分别为78.2%和81.8%)，与正常肺组织比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 2组Lipocalin-2、MMP-9蛋白表达水平比较 例(%)

注：与对照组比较，*P<0.05

2.2 Lipocalin-2表达与MMP-9的关系 43例Lipocalin-2表达阳性的肺癌组织中MMP-9阳性表达率为79.1%(34/43)，12例Lipocalin-2表达阴性的肺癌组织中MMP-9阳性表达率为16.7%(2/12)，2组比较差异有统计学意义(χ2=26.134，P<0.05)。Spearman等级相关性分析显示，Lipocalin-2、MMP-9表达呈明显正相关(r=0.586，P<0.05)。见表2。

表2 Lipocalin-2、MMP-9在肺癌组织表达的相关性比较 例

2.3 Lipocalin-2表达与肺癌临床病理特征的关系 Lipocalin-2阳性表达率随着肿瘤TNM临床分期的增高及淋巴结远处转移而增高(P<0.05)。见表3。

2.4 Lipocalin-2在不同病理类型肺癌组织的表达 Western blot结果显示，Lipocalin-2在肺腺癌组织的表达较鳞癌及正常肺组织显著增高，差异有统计学意义(P<0.05)，而肺鳞癌组织和正常肺组织比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 Lipocalin-2在不同病理类型肺癌组织的表达

类别β-actinLipocalin-2Lipocalin-2/β-actin相对灰度值肺腺癌组织(n=18)68.21±2.3759.32±1.030.87±0.06*肺鳞癌组织(n=24)70.22±2.4641.56±0.770.59±0.11正常肺组织(n=40)74.25±2.7739.89±1.010.54±0.08

注：与正常肺组织比较，*P<0.05

2.5 Lipocalin-2表达与复发转移的关系 术后对肺癌患者跟踪随访3年，结果显示，55例肺癌患者3年总复发率为41.8%(23/55)，Lipocalin-2阳性表达复发率为58.1%(25/43)，Lipocalin-2阴性表达复发率为25.0%(3/12)，差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

Lipocalin-2，即中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白，是属于Lipocalin超家族的一种脂肪细胞因子，其最早被Kjeldsen等[2]在中性粒细胞上清液中发现并分离。研究显示，Lipocalin-2具有广泛的生物学功能，在炎症、代谢综合征、糖尿病及胰岛素抵抗、动脉粥样硬化等病理过程中扮演重要角色，可作为这些疾病发生的风险预测及预后评估的重要指标。研究发现，Lipocalin-2的异常表达参与了包括乳腺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、前列腺癌等多种恶性肿瘤细胞的增殖和侵袭转移过程[3,4]，且随着不同的组织类型其表达水平呈现上调或下调。

恶性肿瘤侵袭和转移的关键步骤是通过降解细胞外基质成分和基底膜突破基质屏障，其中基质金属蛋白酶(MMPs)是发挥降解作用的最重要蛋白水解酶，而MMP-9被认为是MMPs中与Lipocalin-2功能联系最紧密的成员，与肿瘤扩散、侵润和转移密切相关[2]。本研究发现，Lipocalin-2与MMP-9在肺癌组织均异常高表达，且二者表达呈显著正相关(r=0.586，P<0.05)，这与文献报道的在乳腺癌和口腔癌中的研究结果[5,6]一致，提示Lipocalin-2作为一种转移促进基因直接促进了癌细胞的侵润和转移。既往研究显示，Lipocalin-2与MMP-9之间可能存在某种调控作用，共同参与了肺癌的发生发展，其机制可能为Lipocalin-2通过促进MMP-9活化、抑制MMP-9降解，促进了肿瘤的浸润和转移过程[7]。Western blot结果显示，Lipocalin-2在肺腺癌组织的表达多于鳞癌组织，与Cho 等[8]研究结果一致，进一步证实了Lipocalin-2高表达与肺腺癌密切有关。本研究结果也显示，Lipocalin-2阳性表达率随着肺癌临床分期的增高和淋巴结远处转移而增高，另外，Lipocalin-2阳性表达率高的患者术后3年内复发率显著高于Lipocalin-2阴性表达者，提示Lipocalin-2阳性患者具有更强的侵袭转移潜能，肿瘤恶性程度更高，预后更差。

综上所述，Lipocalin-2在肺腺癌组织过度表达，其表达水平与肿瘤TNM临床分期、淋巴结转移及预后密切相关，减低或敲除Lipocalin-2表达有可能成为肺癌生物学治疗的新策略。由此可见，Lipocalin-2在促进肺癌发展进程中起非常重要的作用，其表达水平可为评价肺癌发展、侵袭转移及预后提供重要参考价值，有可能成为肺癌临床治疗的新靶标及判断转移和预后的重要预测因子。

1 Yang J,McNeish B,Butterfield C,et al.Lipocalin 2 is a novel regulator of angiogenesis in human breast cancer.FASEB J,2013,27:45-50.

2 Kjeldsen L,Johnsen AH,Sengelov H,et al.Isolation and primary structure of NGAL,a novel protein associated with human neutrophil gelatinase.J Biol Chem,1993,268:10425-10432.

3 Leng X,Ding T,Lin H,et al.Inhibition of lipocalin 2 impairs breast tumorigenesis and metastasis.Cancer Res,2009,69:8579-8584.

4 Tung MC,Hsieh SC,Yang SF,et al.Knockdown of lipocalin-2 suppresses the growth and invasion of prostate cancer cells.Prostate,2013,73:1281-1290.

5 Sung H,Choi JY,Lee SA,et al.The association between the preoperative serum levels of lipocalin-2 and matrix metalloproteinase-9(MMP-9) and prognosis of breast cancer.BMC Cancer,2012,12: 193.

6 Lin CW,Tseng SW,Yang SF,et al.Role of lipocalin 2 and its complex with matrix metalloproteinase-9 in oral cancer.Oral Dis,2012,18:734-740.

7 须静，胡晓波.中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的研究进展．检验医学，2012，27:871-876.

8 Cho H,Kim JH.Lipocalin 2 expressions correlate siginificantly with tumor differentiation in epithelial ovarian cancer.J Histochem Cytochem,2009,57:513-521.

RelationshipbetweentheexpressionofLipocalin-2andtheprognosisofpatientswithprimarylungcancer

MAXiaogang,YANGXiaoguang,ZHAOZheng.DepartmentofThoracicSurgery,HandanCentralHospital,Hebei,Handan056001,China

ObjectiveTo investigate the expression of Lipocalin-2 and its relationship with MMP-9 as well as prognosis of patients with primary lung cancer.MethodsThe expression levels of Lipocalin-2 and MMP-9 were detected by immunohistochemistry(SP) in 55 cases of lung cancer tissues and 40 cases of normal lung tissues.The relationship between Lipocalin-2 expression and clinicopathological features of lung cancer as well as relapse rate was analyzed.Western blot was used to detect the expression of Lipocalin-2 in lung adenocarcinoma and lung squamous carcinoma.ResultsThe positive expression rates of Lipocalin-2 and MMP-9 in lung cancer tissues were significantly higher than those of normal lung tissues(P<0.05),furthermore,the expression of Lipocalin-2 was positively correlated to that of MMP-9(r=0.586,P<0.05).The positive expression rate of Lipocalin-2 was increased,with the increase of clinical stage and lymph node metastasis of lung cancer.The 3-year relapse rate after operation in patients with higher expression of Lipocalin-2 was significantly higher than that in patients with lower expression of Lipocalin-2(P<0.05).The expression levels of Lipocalin-2 in lung adenocarcinoma were significantly higher than those in lung squamous carcinoma(P<0.05).ConclusionThe overexpression of Lipocalin-2 plays an important role in the invasion and metastasis of primary lung cancer,which can be used as a index for evaluating prognosis of patients with lung cancer．

lung cancer; lipocalin-2; prognosis

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.11.008

056001 河北省邯郸市中心医院胸外科

R 734.2

A

1002-7386(2014)11-1626-03

2013-12-15)