BRCA1、TopoⅡα、Bcl-2在三阴乳腺癌中的表达及对预后的影响

马 静 魏素菊 王俊艳 刘 巍 刘风铃 姜 达

(河北医科大学第四医院肿瘤内科,河北 石家庄 063000)

三阴乳腺癌(TNBC)由于对内分泌及曲妥珠单抗治疗不敏感，故其预后较其他乳腺癌差，治疗较为棘手。因此，加强TNBC分子水平研究，寻找对TNBC敏感、便捷、具有预后影响意义的筛查指标成了一个迫在眉睫的问题。本研究分别检测了26例TNBC与非TNBC病理蜡块中BRCA1、TopoⅡα、Bcl-2的蛋白表达情况，探讨它们与TNBC预后的关系,为TNBC的诊治及预后判断提供新的分子靶点。

1 材料和方法

1.1实验材料 选取2005年及2006年于河北医科大学第四医院行手术治疗的乳腺癌患者的病理蜡块，TNBC及非TNBC各26例，均为女性，术前均未接受放疗、化疗及其他治疗，中位年龄43(23～78)岁。

1.2主要试剂 磷酸盐缓冲液(PBS)、EDTA修复液、抗体稀释液、DAB显色剂、中性树胶、BRCA1单克隆抗体、TopoⅡα单克隆抗体、Bcl-2单克隆抗体等。

1.3主要仪器 不锈钢压力锅、微波炉、吹风机、组化笔、湿盒、烤箱、振荡器、染缸、光学显微镜、纯木浆卫生纸、图像采集系统等。

1.4操作步骤 石蜡包埋的组织块切片，厚度为4 μm，置烤片机上烤2 h，然后置于60℃恒温箱过夜。石蜡切片脱蜡水化，PBS液(pH7.4)冲洗3次，每次5 min。取一定量的修复液于压力锅中，加热至沸腾，将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，继续加热至喷气， 2 min后切断电源，切片冷却至室温以抗原修复。PBS冲洗3次，每次5 min。3%过氧化氢室温孵育10 min，以阻断内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗，每次5 min。滴加4%羊血清封闭，室温30 min，以减少非特异性染色。滴加适当比例稀释的一抗，37℃孵育2 h，采用已知阳性组织切片作阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。PBS冲洗3次，每次5 min。滴加二抗工作液，37℃孵育30 min。PBS冲洗3次，每次5 min。DAB显色: 甩去PBS液，每张切片滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下观察，满意后以自来水充分冲洗终止反应。苏木素复染:陈旧苏木素溶液中浸泡1 min复染细胞核，0.1%盐酸酒精分化，氨水返蓝1～3 min。酒精梯度脱水干燥:75%乙醇、80%乙醇、95%乙醇、无水乙醇各1次，每次5 min;二甲苯透明;中性树胶封片。显微镜下观察阅片并总结染色结果。

1.5结果判断 BRCA1蛋白阳性染色的棕黄色颗粒主要表达在细胞核上。TopoⅡα蛋白阳性染色为棕黄色颗粒,位于胞质和胞膜,Bcl-2蛋白阳性染色的棕黄色颗粒表达在细胞膜上,可见细胞质同时染色。每张切片随机选5个视野(×400)计算阳性细胞数，阳性细胞数小于20%计为0分,20%～50%计为1分,51%～75%计为2分,大于75%计为3分，0～1分计为(-)，2～3分计为(+)。见图1，图2，图3。

图1 BRCA1蛋白在乳腺癌组织中的表达(DAB,×400)

图2 TopoⅡα蛋白在乳腺癌组织中的表达 (DAB,×400)

图3 Bcl-2蛋白在乳腺癌组织中的表达 (DAB,×400)

1.6统计学方法 采用SPSS13.0软件，计数资料组间比较采用χ2检验，生存分析采用Kaplan-Meier法，组间曲线比较用Log-Rank检验。

2 结 果

本研究共纳入52例乳腺癌患者，手术时间从2005年1月至2006年12月，均有明确的术后病理诊断及免疫组化结果。自患者术后第1天开始截止到2011年10月31日，全部病例死亡12例(23.1%)，复发转移21例(40.4%)。BRCA1、TopoⅡα、Bcl-2三个指标阳性者较阴性者有较高的总生存率及无病生存率(见表1)。BRCA1蛋白的表达情况在TNBC与非TNBC中差异显著，低表达与TNBC显著相关，而TopoⅡα和Bcl-2蛋白在TNBC与非TNBC中表达无显著差异。见表2。

表1 各蛋白阴、阳性表达组间总生存率及无病生存率比较(%)

表2 三阴及三阳组三种蛋白的阳性表达率比较〔n(%)〕

3 讨 论

BRCA1基因为参与转录调节、细胞周期调控、诱导细胞凋亡、DNA损伤修复等过程的一种抑癌基因〔1〕。研究证实,BRCA1突变者在40岁以前发生乳腺癌的概率高达19%。BRCA1基因在不同种族和地区的突变不尽相同，BRCA1可作为辅助诊断和治疗乳腺癌的生物标记蛋白〔2，3〕。TNBC与BRCA1突变乳腺癌在表型特征和分子水平上有许多相似之处，如ER阴性，CK5/6、EGFR和Ki-67阳性，P53突变，核分级较高，预后较差等。Cleator等〔4〕研究发现TNBC中大约有30%伴BRCA1基因突变，而伴BRCA1基因突变的乳腺癌中TNBC占90%。Lee等〔5〕检测了1167例乳腺癌患者BRCA1突变情况，发现48%的BRCA1突变者为三阴乳腺癌，而BRCA1未突变者只有12%为TNBC。本研究提示，BRCA1突变与TNBC之间有着密切的联系，故治疗BRCA1相关肿瘤的方法也适合用于治疗TNBC。体外试验显示BRCA1相关乳腺癌因BRCA1功能失活或缺失导致对能破坏DNA结构的药物极其敏感，如铂类药物。国外已进行了多项前瞻性或回顾性临床试验〔6～9〕均证实了铂类药物对TNBC有较好的疗效,尤以BRCA1突变患者对顺铂更为敏感。

TopoⅡα的基因位于染色体17q21～q22位点,与HER-2基因位点相邻,是蒽环类药物的作用靶点,其表达缺失常引起蒽环类药物耐药,而过表达则对蒽环类药物敏感。目前关于TopoⅡα的临床研究结果并不完全一致。Nielsen等〔10〕指出TopoⅡα基因状态可作为患者无病生存率及总生存率的预测因子，TopoⅡα基因缺失者较扩增者预后差。Chan等〔11〕研究亦阐明TopoⅡα基因扩增的患者有更长的无进展生存期。但是，Nakagawa等〔12〕却发现TopoⅡα过表达与TNBC的核分级高、脉管瘤栓显著相关。Tan等〔13〕研究表明TNBC患者很少伴有TopoⅡα基因扩增。Carey等〔14〕阐明尽管TopoⅡα基因常与Her-2基因共同扩增，但蒽环类药物对TNBC患者却有很好的疗效。Park等〔15〕研究指出TopoⅡα基因表达才是预测蒽环类化疗疗效的真正标志物,而HER-2预测蒽环类疗效实际上是通过TopoⅡα表达发挥作用的。本研究中TopoⅡα阳性者较阴性者预后较好，所以对于TNBC患者检测其TopoⅡα基因表达情况对指导用药具有至关重要的作用。

Bcl-2为目前公认的一种细胞凋亡抑制基因，Bcl-2表达与肿瘤大小、细胞增殖程度、肿瘤浸润性密切相关,Poincloux等〔16〕研究显示Bcl-2低表达与包括乳腺癌在内的多种恶性肿瘤预后差有关。Koronakis等〔17〕研究亦证实了TNBC与Bcl-2低表达密切相关。本研究中Bcl-2阳性者较阴性者有明显的生存获益，5年OS及DFS均具有显著性差异，但TNBC与非TNBC中Bcl-2表达无明显差异。

在2011年ASCO年会上报道了Abdel-Fatah等〔18〕的一项研究，对于接受CMF方案化疗的TNBC患者，Bcl-2的表达与死亡率和复发风险相关，具体表现为：Bcl-2(+)的患者为低风险，Bcl-2(-)的患者为高风险。以蒽环类为基础的新辅助治疗是针对Bcl-2表达水平低的TNBC患者的有效治疗方法，并与较高的病理缓解率密切相关。故将Bcl-2纳入到TNBC表型标记有助于制定更好的治疗方案，从而最终改善TNBC患者的预后。

4 参考文献

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11Chan S,Reis-Filho JS,Dickinson PD,etal. Use of topoisomerase Ⅱ α(TopoⅡα) protein overexpression to predict response to anthracycline-based chemotherapy〔J〕.J Clin Oncol,2011;29(15):1027.

12Nakagawa M,Bando Y,Nagao T,etal. Expression of p53,Ki-67,E-Cadherin,N-Cadherinand TOP2A in triple-negative breast cancer〔J〕. Anti Res,2011;31: 2389-94.

13Tan DS,Marchio C,Jones RL,etal. Triple-negative breast cancer: molecular profiling and prognostic impact in adjuvant anthracycline-treated patients〔J〕. Breast Cancer Res Treat,2008;111(1):27-44.

14Carey LA,Dees EC,Sawyer L,etal. The triple-negative paradox: primary tumor chemosensitivity of breast cancer subtype〔J〕. Clin Cancer Res,2007;13:2329-34.

15Park K,Kim J,Lim S,etal. Topoisomerase Ⅱα (topoⅡα) and HER2 amplification in breast cancers and response to preoperative doxorubicin chemotherapy〔J〕. Eur J Cancer,2003;39(5): 631-4.

16Poincloux L,Durando X,Seitz JF,etal. Loss of BCL-2 expression in colon cancer: a prognostic factor for recurrence in stage Ⅱ colon cancer〔J〕. Surg Oncol,2009;18:357-65.

17Koronakis N,Karanikas G,Lagoudianakis EE,etal. Analysis of clinical and molecular associations of triple negative breast cancers in node-negative patients〔J〕. Eur J Gynaecol Oncol,2010;31(3):304-7.

18Abdel-Fatah TMA,Dickinson PD,Moseley P,etal. Bcl-2 as a surrogate prognostic and predictive marker in triple-negative breast cancer〔J〕.J Clin Oncol,2011;29:1024.