硫化氢对脂多糖所致急性肺损伤大鼠血浆和肺组织中炎性细胞因子的影响

代庆春 韩 玉 苗晓云 周晓红 沈洪丽 张晓卫

(沧州市中心医院重症医学科，河北 沧州 061001)

脂多糖(LPS)所致急性肺损伤(ALI)的基础是全身性炎性反应综合征(SIRS)，而SIRS的本质则是失控的或过度的炎性反应〔1，2〕，且SIRS在ALI发展为成人呼吸窘迫综合征(ARDS)的过程中也起着至关重要的作用。目前认为炎症失控是ALI形成的重要原因，而前炎症因子被过度产生，抗炎因子相对或绝对产生不足则是造成炎症失控的根本，也就是所谓的炎症失衡。如何重建促炎反应与抗炎反应间的平衡，已成为阻断炎症介质的瀑布式反应的关键。顾俭勇〔3〕已证实，在LPS致大鼠ALI后血浆中肿瘤坏死因子(TNF)-α和白细胞介素(IL)-4的改变。前期实验已经证实硫化氢(H2S)对LPS所致ALI具有对抗LPS所致的肺损伤保护细胞的作用。然而H2S的保护作用与细胞因子的相关性尚不十分清楚。本文探讨H2S在LPS所致ALI中的作用及其可能机制。

1 材料与方法

1.1动物 清洁级健康雄性SD大鼠210只，购买后实验室饲养1 d，使动物适应实验室环境，由河北省实验动物中心提供。

1.2方法

1.2.1主要试剂 大肠杆菌脂多糖(LPS E.coli O111:B4)、(NaHS)、炔丙基甘氨酸(PPG)均购置于美国Sigma公司；大鼠TNF-α、IL-6、IL-4 ELISA-kit试剂盒购置于法国Diaclone公司。

1.2.2动物模型复制、分组及标本制备 大鼠经乙醚吸入麻醉，仰卧位固定。无菌条件下在颈前正中做长约0.5 cm的切口暴露气管，以7号无菌针头刺入气管，在大鼠竖直位下缓慢滴注药物。滴注以后缝合切口。动物清醒之后，自由活动，禁食，未禁水。将112只大鼠随机分为四组，每组28只，分别取7只于给药2、4、6、8 h后进行观察。在实验结束前的30 min，给大鼠腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉，经舌静脉注入肝素(1 250 U/kg)抗凝，颈部正中切口，颈总动脉插管后放血，留取血浆-80℃保存待分析；同时留取右肺中叶，用以制备肺组织匀浆。对照组：气管内滴注无热原生理盐水(200 μl)；LPS组：气管内滴注LPS(200 μg/200 μl)；LPS+NaHS组：气管内滴注LPS前15 min经腹腔注射0.5 ml NaHS(28 μmol/kg)；LPS+PPG组：气管内滴注LPS前15 min经腹腔注射0.5 ml PPG(45 μmol/kg)。

1.2.3血浆中细胞因子含量 取-80℃保存的血浆应用细胞因子ELISA法，按照试剂盒说明书操作，测定各组给药2、4、6、8 h后血浆中TNF-α、IL-6、IL-4浓度。

1.2.4组织匀浆中细胞因子含量 冻存的组织标本称重后置于匀浆缓冲液中(4℃)，每毫升缓冲液100 mg组织。缓冲液中含蛋白酶抑制剂的混合物，即1 mmol/L PMSF、1 mg/L 胃蛋白酶抑制剂 A、1 mg/L抑肽酶、1 mg/L 亮抑肽酶溶于含5 g/L Triton X-100的PBS中(pH 7.2)。标本匀浆后以18 000 r/min离心。使用上述ELISA试剂盒分析组织上清液中TNF-α、IL-6及IL-4浓度。

2 结 果

2.1H2S对LPS所致ALI大鼠血浆TNF-α、IL-6、IL-4水平的影响 对照组大鼠血浆TNF-α、IL-4的浓度低于检测的下限。各组大鼠血浆中细胞因子的浓度随LPS的刺激而升高，TNF-α、IL-6及IL-4的浓度于滴注LPS后2 h、4 h、6 h达到高峰。LPS+PPG组大鼠血浆TNF-α、IL-6及IL-4的浓度达高峰时间点为LPS滴注后2 h、4 h、8 h； LPS+NaHS组大鼠血浆TNF-α、IL-6及IL-4的浓度达高峰时间点为LPS滴注后2、4、4 h。与对照组相比，LPS组大鼠各时间点的血浆TNF-α、IL-6、IL-4浓度均升高。与LPS组相比， LPS+PPG组大鼠于各时间点上血浆TNF-α、IL-6浓度更高，但血浆IL-4浓度在LPS滴注后2、4、6 h下降，8 h升高； LPS+NaHS组大鼠各观察时间点的血浆TNF-α、IL-6浓度降低，但血浆IL-4浓度在LPS滴注后2、4 h升高，6、8 h下降(P均<0.01)。见表1～表3。

表1 滴注后不同时段大鼠血浆中TNF-α含量的变化

表2 滴注后不同时段大鼠血浆中IL-6含量的变化

表3 滴注后不同时段大鼠血浆中IL-4含量的变化

2.2H2S对LPS所致ALI大鼠肺组织中TNF-α、IL-6、IL-4水平的影响 各组大鼠肺组织中细胞因子的浓度随LPS的刺激而升高，TNF-α、IL-6及IL-4的浓度分别于LPS滴注后2、4、6 h达到高峰。和对照组相比，LPS组大鼠各观察时间点血浆的TNF-α、IL-6、IL-4浓度都升高，差异有统计学意义(P<0.01)。与LPS组相比，LPS+PPG组大鼠各时间点血浆TNF-α、IL-6浓度更高，但血浆IL-4浓度在LPS滴注后2、4、6 h下降，8 h升高； LPS+NaHS组大鼠各时间点的血浆TNF-α、IL-6浓度都有降低，但血浆IL-4浓度在滴注LPS后2、4 h升高，6 h、8 h下降，差异均有统计学意义(均P<0.01)。见表4～表6。

表4 滴注后不同时段大鼠肺组织TNF-α含量的变化

表5 滴注后不同时段大鼠肺组织IL-6含量的变化

表6 滴注后不同时段大鼠肺组织IL-4含量的变化

3 讨 论

近几年研究提示ALI的发生不再局限于单纯的肺部疾病，而是一种广义的，是一种全身系统炎性疾病的肺部临床表现，即多种病因(包括肺内或肺外，感染或非感染)都能直接或间接地引起ALI及ARDS〔1，2〕，随着疾病的进展势必会有更多的炎性细胞被激活，并释放更多的炎性介质或细胞因子，损害信号将进一步放大和加强，形成炎症瀑布效应。肺部多种炎性细胞(如中性粒细胞PMN、肺泡巨噬细胞AM等)所介导的肺部炎性反应及失控的炎性反应是造成ALI的根本原因〔3〕。临床上造成ALI的原因中细菌内毒素是主要病因，其中又以革兰阴性细菌内毒素为主导，而其内毒素的主要活性成分为脂多糖。LPS所致ALI的本质是造成肺部的严重炎性反应及炎性损伤，其过程中不仅有炎症介质的过度释放，而且还伴有内源性抗炎介质的异常释放。有多种细胞因子参与了此过程。在损伤早期，主要参与的炎症因子有TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等。同时在炎症反应发展的过程中，机体还会分泌抗炎性细胞因子来维持机体内环境的稳定〔4，5〕， IL-4、IL-10、IL-13即是重要的抗炎细胞因子，促炎因子和抗炎因子常处在平衡/失衡不断变化之中。

T淋巴细胞在调节疾病进展方面有着重要的作用，其中辅助性T细胞(Th)的作用越来越受到人们的关注。根据Th亚群的不同，将Th分泌的细胞因子分为Th1型和Th2型，两者之间的动态平衡对机体是十分重要的。而两者的标志性细胞又分别为TNF-α与IL-4，所以调控两者之间的动态平衡也很重要。

小剂量TNF-α能参与自身防御，增强PMN的吞噬功能，促进SOD活性，使炎症局部化，提高存活率；但ALI时过度产生的TNF-α则对机体产生了较大的伤害，因此其被认为是ALI时炎症介质级联反应的启动因子〔6〕。它可以加强PMN的趋化并在肺内聚集，从而激活单核/巨噬细胞、PMN等释放更多的炎症介质；随后内皮被激活，PMN的黏附作用加强了，肺微血管通透性也增加了，肺顺应性相应降低，最终导致了ALI〔7，8〕。相关研究认为，细胞因子TNF-α在过度炎症反应中起重要的作用。

IL-6是一种具有多潜能的细胞因子。不仅能对组织直接造成伤害，还能增强组织细胞对TNF-α的敏感性〔9〕。而且在SIRS反应中，LPS不仅可直接诱导机体产生IL-6，同时在TNF-α诱导下机体会产生IL-1β；而IL-1β又可刺激IL-6的生成。由此我们可以看出，IL-6在SIRS病理生理发生发展的过程中起着重要的作用〔10～14〕。

IL-4是由单核细胞、淋巴细胞产生并释放的，因其能抑制LPS诱导前炎性细胞因子的产生，所以被归为抗炎细胞因子，但实际上它是多效性的细胞因子。它也可以被TNF-α诱导合成，只是与IL-6的途径不同而已。

本研究提示了TNF-α可经IL-1β诱导产生IL-6的可能，内源性H2S生成减少可能是前炎性细胞因子增多的原因之一，外源性H2S可以抑制LPS所致ALI大鼠血浆和肺组织中TNF-α、IL-6浓度水平的升高，说明在LPS所致的ALI中，H2S保护细胞的机制之一，就是能够抑制促炎因子的增加，从而减轻机体过度的炎症反应。

本实验还发现，IL-4也参与了LPS所致ALI的炎症反应过程，并且可以看出抗炎反应要晚于促炎反应。这提示在炎症早期主要是促炎因子的大量释放,是机体为了抵御内毒素的入侵，将炎症反应扩大化的一个过程，但随着促炎信号的不断放大，机体又为了避免其对机体造成过大的伤害并对机体进行修复，则会不断产生抗炎因子并抑制促炎因子的释放，来维持促炎/抗炎之间的动态平衡，使炎症局限化并好转。在早期多种炎性细胞的激活和一系列炎性介质的释放，虽然会对机体造成一定的损伤，但总体来说是有益的。但如过度的反应，就会形成炎症瀑布效应，对机体造成致命性的打击。而抗炎介质也是一样，在炎症反应发生时，其使之趋于局限化，对维持机体内环境的稳定，避免过度的炎性损伤是有利的。但如果抗炎介质过量，就会造成机体免疫功能低下而使其易感性增加。所以维持促炎/抗炎之间的动态平衡，能够恰当地发挥其作用将是研究的主题。

本研究不仅发现了IL-4参与了LPS所致ALI的炎症反应过程，还证明H2S是通过促进抗炎因子的表达并使其释放高峰提前来对抗LPS所致ALI，可以看出H2S对炎性因子有着较大的影响，其不仅能够抑制促炎因子TNF-α、IL-6的表达，而且还可以促进抗炎因子IL-4的表达并使其释放高峰提前来减轻机体过度的炎症反应，从而对抗LPS所致ALI。

4 参考文献

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3顾俭勇.脂多糖致大鼠急性肺损伤后血浆TNF-α、IL-1β和IL-4的改变〔J〕.山东医药，2009；49(4)：41-2.

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