姜黄素对大鼠全脑缺血/再灌注后的保护机制

李天平 陈俞先 徐 珽

(四川大学华西药学院，四川 成都 610041)

目前脑缺血尚无有效的治疗方法。N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体介导的兴奋毒性是缺血性脑损伤发生的关键机制之一〔1〕。NR1作为NMDA结构受体，在海马组织的选择性表达是海马容易发生缺血性损伤的原因之一〔2〕。脑源性神经营养因子(BDNF)在保护局部性脑缺血所诱发的细胞坏死凋亡过程中起重要作用。BDNF能够提高神经元的存活率和突触的可塑性，抑制短暂性脑缺血引发的细胞损伤，可以避免局部性脑缺血所产生的海马CA1区的神经细胞坏死凋亡。姜黄素因其具有抗炎、抗氧化的作用〔3〕，在神经系统疾病治疗研究中有重要的地位。有研究〔4〕显示姜黄素能减轻脑缺血/再灌注(I/R)后神经细胞凋亡,但这是否与减轻兴奋性神经毒有关目前尚不清楚。本实验考察脑组织海马神经细胞形态学变化及BDNF、NR1 mRNA及蛋白表达变化，从而进一步探索姜黄素抗缺血性脑损伤的机制。

1 材料与方法

1.1主要试剂 NR1抗体(Sigma公司)、BDNF抗体(Sigma公司)兔抗鼠二抗(Chemicon公司)、RT-PCR试剂盒(日本Takara)和实时定量PCR试剂盒(日本Takara);姜黄素(美国Sigma公司)。

1.2动物模型 18只清洁级沙鼠 10～12周龄，体重275～350 g,由实验动物中心提供。动物随机分成三组:假手术组(SH)、I/R组、治疗组(姜黄素100 mg/kg)。治疗组在缺血后给予动物100 mg/kg姜黄素腹腔注射，每5 h注射1次。在再灌注3 d后对各组提取样本。

1.3模型制备 参照Pulsinelli的方法并改进，构建颈动脉双侧血管阻断全脑I/R的沙鼠模型。沙鼠经水合氯醛麻醉后,分离双侧颈总动脉，用无创动脉夹夹闭双侧颈总动脉10 min，重新恢复血流，缝合皮肤。治疗组腹腔注射溶于二甲基亚矾(DMSO)的姜黄素100 mg/kg。控制室温在36℃～37℃。使用神经功能评分判定全脑I/R造模成功。

1.4神经功能评分 再灌注3 d后，对各组沙鼠进行Garcia神经功能评分。功能正常时得分最高为18 分，功能损伤越严重越低。

1.5RT-PCR法测定BDNF、NR1 mRNA含量 提取海马总mRNA，参照试剂盒说明书进行实时定量RT-PCR含量标准曲线法进行定量，检测海马NR1 mRNA和BDNF mRNA含量引物序列，见表1。

1.6Western印迹法测定BDNF和NR1的蛋白表达 沙鼠水合氯醛麻醉，迅速断头剥取海马，加入500 μl RIPA裂解液，超声匀浆后低温高速离心，取上清液。BCA法测蛋白浓度，上样，电泳，一抗(抗NR1，1∶400稀释； 抗-BDNF，1∶200稀释；β-actin，1∶5 000稀释)孵育，二抗1∶5 000稀释，化学发光法(ECL)显影。实验结果用Quantity One软件分析。

2 结 果

2.1神经功能评分 沙鼠在再灌注后开始表现一定程度的行为学紊乱，3 d后，对各组沙鼠进行其Garcia神经功能评分。姜黄素治疗后，沙鼠评分由8.23±0.59上升到13.32±0.72(P<0.01,n=6)，有显著疗效，SH组为16.5±0.212沙鼠的行为有一定程度的恢复。

2.2海马组织NR1、BDNF mRNA表达 I/R组海马中BDNF mRNA(0.72±0.13)比SH组(0.52±0.04)升高(P<0.05)，而给予100 mg/kg的姜黄素后会使BDNF mRNA增加到0.96±0.07(P<0.01)。I/R组 NR1 mRNA(0.89±0.05)与SH组(1.56±0.02)相比降低(P<0.05)，而治疗组的表达则是上升到了1.29±0.05(P<0.01)。

2.3海马组织NR1和BDNF的蛋白表达 姜黄素使沙鼠脑I/R后海马组织中的BDNF和NR1的蛋白表达上调；I/R组海马CA1区BDNF上调、NR1蛋白下降(P<0.01)。见表2，图1。

表1 实时定量RT-PCR检测BDNF mRNA和NR1 mRNA表达的引物序列

表2 NR1、 BDNF蛋白在各组脑海马组织中的浓度比值

图1 姜黄素对沙鼠海马BDNF 和 NR1的蛋白含量的影响

3 讨 论

本实验研究结果显示：用姜黄素预处理的沙鼠可以显著保护海马的神经元细胞，并能对沙鼠行为模式产生影响。姜黄素对BDNF和NR1有明显的调节作用。海马神经元的形态学变化和坏死是脑缺血后神经细胞死亡的主要形式〔6〕。

NMDA的受体蛋白是由必须的结构亚型NMDAR1和调节亚型NMDAR2两种亚单位构成的异聚体〔4〕。NR2蛋白与N1蛋白结合后对其功能及特性起辅助修饰作用，而不能独立的发挥作用。因此,本实验选择脑缺血后NR1蛋白表达的变化来反映NMDAR蛋白在脑I/R后的变化。缺血后胞质内Ca2+含量的增加是启动细胞变性凋亡的关键因素,而钙超载主要由NMDA受体介导〔6〕。BDNF作为脑神经营养因子，在神经系统疾病中的保护作用不可忽视，研究〔4〕显示 BDNF可能会在再灌注后保护性的增加以减少神经元的损伤。有研究表明,姜黄素预先给药可减少全脑I/R后脑海马组织的神经细胞凋亡〔7〕。

I/R作为一个理想的脑缺血模型，有着重要的研究意义。深入的研究显示〔8〕，缺血后再灌注4 h后就会造成脑部损伤至3 d脑损伤的神经元细胞会达到最低谷，7 d时开始恢复。本次实验选择100 mg/kg姜黄素对I/R的脑损伤有保护作用，是由于姜黄素在体内代谢的特性选择的，有研究〔9〕发现姜黄素的治疗浓度存在范围，100 mg/kg和300 mg/kg抗缺血神经细胞凋亡效果不如200 mg/kg,这可能与300 mg/kg姜黄素增加NR2B蛋白表达而启动凋亡信号通路有关〔10〕。这也提示只有在一定剂量范围内姜黄素才具有抗缺血性神经细胞凋亡效应。

总之,预先给予适量姜黄素能有效减少沙鼠I/R造成的海马神经细胞变性和坏死,这可能与增强BDNF的保护机制和调节NR1的双向调节有关; 50～500 mg/kg姜黄素可能为一个抗缺血性神经细胞变性坏死的有效药物浓度范围，这可能与姜黄素在体内对肝药酶的剂量依赖性诱导有关〔11〕。

4 参考文献

1程发峰，宋文婷，郭少英,等.三种神经功能评分在鼠类局灶性脑缺血模型评价中的比较〔J〕.中国康复医学杂志,2011;26(4)：337-41.

2Ogawa S,Kitao Y,Hori O. Ischemia-induced neuronal cell death and stress response〔J〕.Antioxid Redox Signal,2007;9(5): 573-87.

3Maheshwari RK, Singh AK,Gaddipati J,etal. Multiple biological activities of curcumin: a short review〔J〕.Life Sci,2006;78(18): 2081-7.

4陈伟峰，周 丹，何卫平,等.大鼠急性脑缺血再灌注损伤中BDNF与NGF的变化〔J〕.海南医学院学报,2006;12(2)：106-8.

5许东晖，王 胜，金 晶,等.姜黄素的药理作用研究进展〔J〕.中草药，2005;36(11)：1737-44.

6曹 红，李 军，李广明，等.姜黄素对沙土鼠脑缺血/再灌注损伤的海马CA1区细胞凋亡和即早基因c-fos、c-jun、NF-kB表达〔J〕.中国应用生理学杂志,2007;23(2):184-8.

7李江伟.红花黄色素对家兔血浆纤溶酶原激活剂及抑制剂水平的影响〔J〕.中草药,1999;30(2):128-9.

8张 忱，李 刚，徐娅萍,等.大鼠局灶性脑缺血再灌注模型的再灌注时间窗〔J〕.中日友好医院学报,2000;14(5): 255.

9王 旗.姜黄素的代谢研究〔J〕.中国药理学通报,2003;19(10)：1097-101.

10梁 辉，范金英，李爱华，等.羟基红花黄色素A对大鼠局灶性脑缺血再灌注NMDAR1蛋白表达的影响〔J〕.中华老年心脑血管病杂志,2004;6(3)：194-7.

11周 瑞，徐春红，李 军,等.姜黄素对缺血/再灌注大鼠海马神经细胞凋亡及NR2A、NR2B表达的影响〔J〕.中国药理学通报,2008;24(10)：1314-8.

12朱元贵,陈晓春,陈志哲,等.姜黄素对皮层神经元氧化损伤的保护作用〔J〕.中国药理学通报,2004;20(10):1153-7.