RP-HPLC-DAD法初步考察5种化合物对照品的稳定性

顾志荣，丁军霞，王亚丽，孙宇靖

(1.甘肃中医学院药学院，甘肃 兰州 730000;2.甘肃中医学院 当归研究所，甘肃 兰州 730000)

阿魏酸、正丁基苯酞、Z-藁本内酯、正丁烯基苯酞以及亚油酸是中药分析及植物成分分析中常见的5种化合物［1］。其中，正丁基苯酞、Z-藁本内酯以及正丁烯基苯酞属内酯类化合物，均为油状，易通过氧化、水解、光解和异构化等发生结构改变［2］。这些化合物集中分布在伞形科植物中，特别在藁本属(Ligusticum)植物中几乎均含有，具有扩血管、镇痛、解痉、平喘及抗肿瘤等多重作用［3］。阿魏酸是重要的植物酚酸类成分，是植物细胞壁中与多糖和木质素交联的部分，是当归、川芎、阿魏、升麻等多种常用中药的主要有效成分，具有抗氧化、清除自由基以及抗紫外线等作用，广泛应用于医药、保健品、化妆品、农药和食品添加剂等方面［4］。但阿魏酸在水中稳定性差，见光易分解，易与阿魏酸松柏酯相互转化［5］。亚油酸是人体无法合成的必须脂肪酸，其不饱和键具有降低血清胆固醇的作用［6］，其铝盐广泛用于制造油漆、涂料等，但其在空气中易发生自氧化。由于这5种化合物常温下在空气中均不稳定，因此给标准物质的制备及成分定性定量检测带来很大困难。

目前，对这5种化合物稳定性的考察笔者未见报道，本研究采用RP-HPLC-DAD法研究5种对照品的甲醇混合溶液的稳定性。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

对照品阿魏酸(中国药品生物制品检定所，批号131187-100504);正丁基苯酞(批号342-12-11)及亚油酸(批号245-12-06)来自美国迪玛公司;正丁烯基苯酞(批号2546-06-4)及Z-藁本内酯(批号2456-03-2)为天津一方科技有限公司产;甲醇，色谱纯;超纯水(自制，电阻率≥18.2 MΩ·cm)。

Agilent 1100 LC/DAD系统(G1312A二元梯度洗脱泵;G1315B DAD检测器;Agilent化学工作站;G1313A进样器;G1316A柱温箱);BT1250型电子天平;KQ-500DE超声波清洗器。

1.2 供试品混合溶液的配制

分别精密称取阿魏酸、正丁基苯酞、Z-藁本内酯、正丁烯基苯酞、亚油酸对照品适量，加甲醇制成质量浓度分别为420，860，686，1 000，680 μg/mL 的混合对照品溶液。分别精密吸取上述溶液各1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀即得。

1.3 色谱条件

Waters X-Bridge C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm)色谱柱;流动相为甲醇(B)-水(A)，梯度洗脱条件见表1;体积流量0.8 mL/min，检测波长:阿魏酸、正丁基苯酞、Z-藁本内酯及正丁烯基苯酞280 nm，亚油酸206 nm。柱温30℃，进样体积10μL。

2 结果与讨论

2.1 色谱行为

在1.3节色谱条件下，精密吸取混合供试品甲醇溶液10μL进样，色谱图见图1。

图1 5种化合物的HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of 5 chemical compounds

由图1可知，阿魏酸、正丁基苯酞、正丁烯基苯酞、Z-藁本内酯、亚油酸的保留时间分别为11.177，21.753，33.718，34.067 min 和 34.396 min，分离度均大于1.5，理论板数(按阿魏酸色谱峰计算)不低于5 000。

2.2 12 h内稳定性考察

精密吸取混合供试品甲醇溶液10μL，按1.3节色谱条件每隔2 h进样1次，连续进样6次，结果见表2和图2。

表2 5种化合物12 h内峰面积的变化Table2 Peak area change of 5 chemical compounds in 12 h

由图2可知，5种化合物在甲醇溶液中于12 h内均稳定，但色谱图的基线越来越不平稳。由表2可知，5种化合物在甲醇溶液中于12 h内色谱峰面积基本稳定，RSD均小于2.0%。由此可知，5种对照品混合物的甲醇溶液12 h内稳定性较好，测试时不需新鲜配制。

图2 5种化合物12 h内的HPLC色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of 5 chemical compounds in 12 h

2.3 4 d内稳定性考察

精密吸取混合供试品甲醇溶液10μL，按1.3节色谱条件每天(白天测定)进样3次，每次间隔4 h，连续测定4 d(实验室温度17.4 ～ 21.8℃，相对湿度55% ～64%)，结果见图3和表3。

由图4可知，5种化合物在甲醇溶液中于2 d内及第3 d前8 h内均稳定，但色谱图的基线随放置时间的增加越来越不平稳。从第3 d后4个小时开始，混合供试品开始出现分解，分解所得物质的色谱峰分别为a、b及c，至第4 d全面分解，分解所得物质的色谱峰为a～g。化合物分解后的HPLC图谱杂峰较多，噪声较大，基线不平稳。

表3 5种化合物4 d内峰面积的变化Table3 Peak area change of 5 chemical compounds in 4 d

由表3可知，正丁烯基苯酞和亚油酸4 d内色谱峰面积基本稳定，RSD均小于3.0%，而阿魏酸、正丁基苯酞以及Z-藁本内酯4 d内色谱峰面积的变化较大，RSD均大于6.0%，且峰面积呈减少趋势，因此推测4 d内分解的对照品可能为阿魏酸、正丁基苯酞以及Z-藁本内酯，但分解的途径及产物需要作进一步研究。由上述分析可知，5种对照品混合物的甲醇溶液在2 d内(亦可为56 h内)稳定性较好，不需新鲜配制，超过56 h则需新鲜配制。

1，2，3 d表示当日第2次进样所得图谱;3 d(3)表示第3 d第3次进样所得图谱;4 d(1)表示第4 d第1次进样所得图谱。

图3 5种化合物4 d内的HPLC色谱图Fig.3 HPLCchromatograms of 5 chemical compounds in 4 d

2.4 精密度考察

精密吸取混合供试品甲醇溶液10μL，按1.3节色谱条件连续进样6次，结果阿魏酸、正丁基苯酞、正丁烯基苯酞、Z-藁本内酯以及亚油酸峰面积的RSD 分别为 0.81%，1.13%，1.39%，0.54%，1.90%;保留时间的 RSD 分别为 0.89%，0.93%，0.73%，1.05%，2.03%。结果表明，该仪器及方法日内运行精密度良好。

3 结论

(1)阿魏酸、正丁基苯酞、正丁烯基苯酞、Z-藁本内酯以及亚油酸对照品混合物的甲醇溶液于56 h内稳定性较好，不需新鲜配制，超过56 h则需新鲜配制。

(2)对照品混合物从第3 d后4个小时开始出现分解，分解的对照品可能为阿魏酸、正丁基苯酞以及Z-藁本内酯。

［1］ Qian Y Y，Wang Y L，Sa R N，et al.Metabolic fingerprinting of Angelica sinensis during growth using UPLC-TOFMS and chemometrics data analysis［J］.J Chem Centr，2013(7):42-47.

［2］ 魏玉平，刘俊，廖杰，等.GAP基地川芎药材中苯酞类成分的监测［J］.中国药学杂志，2004，39(11):817.

［3］ 左爱华，王莉，肖红斌.洋川芎内酯A和洋川芎内酯I的降解产物研究［J］.中草药，2012，43(11):2127-2131.

［4］ 郑妍，朱利民.酚酸类化合物的应用及改性研究新进展［J］.应用化工，2007，36(9):918-921.

［5］ 李韶菁，张迎春，苏培瑜，等.阿魏酸松柏酯的研究进展［J］.中国实验方剂学杂志，2011，17(3):229-231.

［6］ 张春娥，张惠，刘楚怡，等.亚油酸的研究进展［J］.粮油加工，2010(5):18-21.