黄芪对大鼠肾脏缺血再灌注损伤的保护作用及其对细胞凋亡影响的研究

郭保伟 付刚 刘艳梅 邱道显 马志鹏

细胞凋亡在临床上十分常见, 譬如器官移植排斥反应及器官缺血再灌注损伤都存在细胞凋亡。黄芪对心、脑缺血再灌注损伤具有一定保护作用, 但对肾缺血再灌注损伤是否具有保护作用及其凋亡影响的研究报道较少。本研究目的是观察黄芪注射液对肾脏缺血再灌注损伤的保护作用及其对细胞凋亡影响, 探讨其可能机制, 为临床应用黄芪防治肾脏缺血再灌注损伤提供实验依据和理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料 健康清洁级SD大鼠30只, 体质量(240±10)g,购自青岛市动物实验中心。

1.2 药品与试剂 尿素氮、肌酐、丙二醛、超氧化物歧化酶试剂盒均购自上海生物研究所, 黄芪注射液由成都地奥九泓制药厂生产, 原位细胞凋亡(TUNEL)试剂盒、SP二抗免疫组化试剂盒购自武汉博士得生物工程有限公司。

1.3 方法 模型制备将SD大鼠术前饲养1周, 手术前禁食6 h, 将实验动物随机分为三组(n=10), A组为缺血再灌注组,B组为黄芪治疗组, C 组为正常对照组。A组从门静脉注入NS1.2 ml/100 g, 10 min后夹闭肾动脉, 当阻断45 min后去除肾动脉夹再灌注, 肉眼观察肾脏由暗红色变为鲜红色, 说明肾脏再灌注成功, 缝合切口, 24 h后采血；B组用黄芪针剂1.2 ml/100 g代替NS, 其余处理同再灌注组；C组从门静脉注入NS 1.2 ml/100 g, 但不夹闭肾动脉, 等暴露45 min后缝合切口。切口缝合后继续喂养24 h, 自由摄水, 进食。24 h后麻醉取血液标本, 行有关酶学和生化指标检测。切除大鼠肾脏, 用4%低聚甲醛溶液固定, 石蜡包埋并编号, 待做病理学检查。

1.4 检测指标及方法

1.4.1 血清BUN、Cr、SOD、MDA测定 采集各组的血液标本, 用生化分析仪测定各组血肌肝、尿素氮含量。血浆中的SOD测定用黄嘌呤氧化酶法, 血浆中的MDA测定用试剂盒说明书操作。

1.4.2 肾组织切片制备 将用4%低聚甲醛溶液固定, 石蜡包埋并编号的标本, 4 μm厚连续切片, 行HE染色观察。

1.4.3 凋亡指数的检测 利用TUNEL法检测细胞凋亡指数, 凋亡细胞镜下胞体缩小, 核膜皱缩, 染色不均匀, 细胞核中有棕黄色颗粒, 可见核固缩及核碎裂。每张切片在400倍镜下观察10个连续不重叠视野, 计数凋亡细胞数和细胞总数, 凋亡指数=(凋亡细胞数/总细胞数)×100%。

1.4.4 Bcl-2蛋白表达 用免疫组化SABC法测定Bcl-2蛋白表达。Bcl-2阳性表达为胞浆染色呈棕黄色, 而Bax蛋白阳性表达表现为胞浆染色黄褐色, 每张切片在400倍镜下观察10个连续不重叠视野, 后用HPIAS-1000高清晰彩色病理图像免疫组化软件分析其平均灰度值, 可视为Bcl-2或Bax的相对含量。

1.5 统计学方法 采用SPSS18.0软件统计数据。计量数据以均数±标准差(±s)表示, 采用t检验, 计数资料采用χ2分析, P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血BUN、Cr、SOD、MDA的测定结果 A组与C组比较, 前者术后BUN、Cr水平明显高于后者, 二者比较差异具有统计学意义(P<0.05), B组与A组比较, 后者较前者术后BUN、Cr水平显著下降, 二者比较差异具有统计学意义(P<0.05)。A组和B组血浆SOD均显著低于C组(P<0.05), 而MDA水平显著高于C组(P<0.05), B组血浆SOD显著高于A组(P<0.05), 而MDA显著性低于A组(P<0.05), 具体见表1。

2.2 肾脏组织病理 ①光镜下病理变化：正常对照组肾小管结构基本正常, 肾小管上皮细胞无变性坏死, 腔内未发现管型。黄芪治疗组肾小管上皮细胞肿胀明显, 空泡可见变性,肾小管上皮细胞局部见到坏死脱落, 间质可见出血。缺血再灌注组肾皮质肾小管坏死广泛, 肾间质局部出血、水肿, 并见蛋白管型, 可见到肾小管轮廓, 肾小球结构基本完整。比较而言, 黄芪治疗组与缺血再灌注组比较, 病理改变明显减轻。②肾小管细胞凋亡指数变化：在光学显微镜下, 凋亡细胞的胞核中有棕黄色颗粒, 可见核固缩及核碎裂。以远端肾小管上皮细胞多见, 近曲肾小管上皮细胞和间质少见, 肾小球未见到凋亡细胞。治疗组凋亡指数明显低于缺血再灌注组(P<0.05)。③Bcl-2及Bax蛋白表达情况：结果表明Bcl-2及Bax蛋白表达以肾小管上皮细胞为主, A组与C组比较, Bax表达显著增强, 二者比较差异具有统计学意义(P<0.01), 而Bcl-2表达略增强(P<0.05), Bcl-2/ Bax比值明显下降, 二者比较差异具有统计学意义(P<0.01)；B组与A组比较, Bax表达下降明显, 二者比较差异具有统计学意义(P<0.05), Bcl-2表达明显增强, 二者比较差异具有统计学意义(P<0.01), Bcl-2/Bax比值升高, 二者比较差异具有统计学意义(P<0.01), AI显著低于A组(P<0.05)。具体见表2。

表1 血BUN、Cr、SOD、MDA的测定结果(±s)

表1 血BUN、Cr、SOD、MDA的测定结果(±s)

注：a, 与C组比较, P<0.05；b, 与A组比较, P<0.05；c, 与C组比较, P<0.05；d, 与A组比较, P<0.05

组别 例数 BUN(mmol/L)Cr(μmol/L)SOD(U/ml)MDA(μmol/ml)A 10 14.25±2.13a 276.67±3.18a 170.45±14.27c 8.998±0.345c 10 9.40±2.60b 100.42±4.02b 241.69±19.00cd 6.206±0.599cd C 10 7.21±3.31 75.93±5.24 335.63±14.688 4.560±0.235 B

表2 各组Bcl-2、Bax蛋白表达情况及凋亡指数的比较(±s)

表2 各组Bcl-2、Bax蛋白表达情况及凋亡指数的比较(±s)

注：与C组比较, a, P<0.01, b, P<0.05；与A组比较, c, P<0.05, d, P<0.01

10 0.1430±0.02b 0.2029±0.03a 0.70±0.06a 28.5±4.4 B 10 0.2643±0.02d 0.1589±0.03c 1.65±0.15d 15.6±3.5c C 10 0.1125±0.05 0.1038±0.03 1.07±0.04 3.10±2.2组别 例数 Bcl-2 Bax Bcl-2/Bax AI A

3 讨论

药理学研究表明黄芪具有补气升阳、扶正祛邪、抗毒排脓、益气利水等功效, 从西医角度上讲即具有抗炎、利尿、强心及促进免疫等多种作用, 近年来有研究发现黄芪还能降低自由基生成和增加自由基的清除作用［1,2］。研究表明黄芪的活性成分可以清除自由基, 预防生物膜的脂质过氧化［3］。本实验用黄芪注射液干预下, 黄芪治疗组与缺血再灌注组比较, SOD活性和MDA含量差异具有统计学意义(P<0.05), 提示该药具有保护SOD的活性, 减轻脂质过氧化损伤, 从而对肾脏缺血再灌注损伤具有保护作用, 这与国内杨岳等［4］报道相一致。细胞凋亡不同于细胞坏死, 前者是由特定的基因调控实现的, 是维持机体自身稳定的重要机制之一。细胞凋亡可参与缺血再灌注损伤, 但确切机制仍未阐明。Bcl-2家族是目前最受重视的凋亡相关基因家族。Bcl-2可阻止细胞凋亡, Bax可促进细胞凋亡。本研究通过对凋亡调控基因Bcl-2和Bax的检测发现, 正常情况下, 在肾小球和肾小管区Bax表达较弱, 而Bcl-2在肾小管区表达较强, 在总体上这两类基因处于相对平衡状态。当应用黄芪治疗后, 观察到Bax的表达明显下调, 而Bcl-2基因表达显著增强, 细胞凋亡明显减轻, 肾小管细胞得到保护, 这与张春军等［5］研究结果相吻合。通过凋亡指数的测定发现：黄芪治疗组和缺血再灌注组肾脏细胞凋亡指数与对照组相比较显著升高, 差异具有统计学意义(P<0.01), 黄芪治疗组肾脏细胞凋亡指数显著低于缺血再灌注组(P<0.05), 因此认为黄芪对肾脏缺血再灌注损伤具有保护作用, 其机制可能部分是通过调节凋亡调控基因Bcl-2和Bax的表达来降低细胞凋亡指数实现的。

［1］张金国, 高东升, 魏广和, 等.黄芪注射液对急性心肌梗死早期患者左室重塑及心功能的影响.中国中西医结合杂志, 2002,22(5):346-348.

［2］苏群, 方强.黄芪与牛磺酸对急性病毒性心肌炎患者血脂质过氧化物的影响.浙江预防医学, 2001, 13(6):9-10.

［3］许静, 秦小红, 薛梅.黄芪对D-半乳糖衰老大鼠脂质过氧化及红细胞免疫功能的影响.江苏医药, 2007, 33(6):596-597.

［4］杨岳, 谢席胜, 艾娜, 等.黄芪三七合剂对大鼠肾缺血再灌注损伤的作用及机制研究.华西医学, 2013, 28(4):500-504.

［5］张春军, 董琦, 董凯, 等.黄芪对大鼠脑缺血再灌注损伤c-fos和Bcl-2表达及细胞凋亡的影响.新乡医学院学报, 2011,28(4):425-427.