肠三叶因子对胃黏膜上皮细胞增殖的影响及其信号转导机制的研究

孙兆瑞，杨志洲，林金锋，邵旦兵，刘红梅，徐 敏，张 炜，孙宝迪，任 艺，邵斌霞，许宝华，唐文杰，聂时南

0 引 言

肠三叶因子(intestinal trefoil factor，ITF)属于三叶肽家族(trefoil factor family，TFF)，是一种小分子多肽物质，主要在小肠及结肠杯状细胞、胃窦黏膜中表达，具有重要的胃肠道黏膜保护和修复作用［1-5］。ITF具有较强的细胞保护作用，可促进胃肠道黏膜上皮细胞增殖迁移，减轻多种损伤因子介导的黏膜损害，抑制细胞凋亡，因而在胃肠道自我保护机制中具有重要作用［6］。尽管目前对ITF生理功能和理化性质的研究较为深入，但其引起胃黏膜上皮细胞增殖的具体分子机制尚未阐明，特别是有关ITF发挥作用的信号转导机制报道较少。本文主要以体外培养的胃黏膜上皮细胞株GES-1为模型，观察ITF对胃年膜上皮细胞增殖作用的影响，并初步探讨ITF促进增殖的信号转导机制与PI3K/Akt在胃黏膜上皮细胞生理过程中的调控作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料 GES-1系购自中国科学院上海细胞库。FBS、DMEM高糖培养基(美国 GIBCO公司)，ITF(美国 PeproTech 公司)，p-Akt、Akt抗体、LY294002(美国 Cell Signaling Technology公司)，β-actin抗体(英国Abcam公司)，CCK-8试剂盒(日本Dojindo公司)。

1.2 GES-1细胞的培养 无菌条件下用含10%FBS的DMEM高糖培养基(加入1%L-谷氨酰胺、1%青链霉素)培养GES-1，以1×106个/mL的密度接种于100 mm的细胞培养皿中，置于37℃、5%CO2饱和湿度的细胞培养箱中，恒温培养，每3天换液1次，直至细胞生长至80%融合。0.25%胰酶-EDTA消化细胞，以1∶2的比例传代。倒置相差显微镜(日本Nikon公司)下观察细胞的生长情况。

1.3 不同浓度ITF对GES-1细胞增殖活力的影响以2×105个GES-1细胞的密度接种于96孔板，每孔加100μL细胞培养基，置于37℃、5%CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养至贴壁完全。分别加入不同浓度的ITF进行培养，并形成ITF低浓度组(100 ng/mL)与ITF高浓度组(500 ng/mL)，另设未处理GES-1细胞为空白对照组。3组细胞分别持续培养24、48、72 h后吸去培养基，PBS洗 2遍，以无血清DMEM高糖培养基∶CCK-8=10∶1的比例混匀，每孔加入100μL，37℃、5%CO2饱和湿度的细胞培养箱中孵育2h，采用Microplate reader酶标仪检测细胞在波长450nm的A值。采集数据并使用Origin 7.5软件进行作图。

1.4 PI3K/Akt信号通路抑制剂 LY294002对GES-1细胞增殖活力的影响 以2×105个GES-1细胞的密度接种于96孔板，每孔加100蘈细胞培养基，置于37℃、5%CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养至贴壁完全。将培养后的细胞分为4份，其中1份未做处理(空白对照组)、2份加入100 ng/mL ITF(ITF 组)、15 μmol/L LY294002(LY 组)，另1 份分别加入 100 ng/mL ITF 和 15 μmol/L LY294002(ITF+LY294002 组)。持续培养 24 h、48 h、72 h 后，光镜下观察4组GES-1细胞生长状态。然后吸去培养基，PBS洗2遍，以无血清DMEM高糖培养基∶CCK-8=10∶1 的比例混匀，每孔加入 100 μL，37 ℃、5%CO2饱和湿度的细胞培养箱中孵育2 h，采用Microplate reader酶标仪检测细胞在波长450nm的A值。采集数据使用Origin 7.5软件进行作图。

1.5 Western blot技术检测PI3K/Akt信号通路蛋白的表达情况 GES-1细胞接种于100 mm细胞培养皿中。待细胞贴壁后，加入100ng/mL的ITF，分别于处理 0、5、10、15、30、60、120 min 后提取细胞蛋白，Western blot检测p-Akt和Akt蛋白表达情况。实验分组方法同1.4。分别提取4组细胞蛋白进行Western blot分子实验，检测p-Akt和Akt蛋白表达情况。

1.5.1 细胞蛋白提取过程 取出培养皿，培养的细胞弃上清后用冰冷PBS洗涤2次，每孔加入300 μL RIPA 裂解液(50 mmol/L Tris-HCl pH=7.4、150 mmol/L NaCl、1%NP-40、0.1%SDS、1 × 蛋白酶抑制剂)，用刮刀刮下细胞后收集于离心管中，冰上裂解30 min。以13 800×g离心力离心30 min，取上清，测定上清体积。从上清中取5 μL用PBS稀释10倍，采用Bradford法测定蛋白浓度，将各样品调至等浓度。按样品∶凝胶加样缓冲液=4∶1的比例加入5×凝胶加样缓冲液(50%甘油、250 mmol/L、pH=6.8 Tris-HCl、10% 巯基乙醇、0.25% 溴酚蓝、10%SDS)。90℃水浴10min，分装后冻存于-80℃。

1.5.2 Western blot过程 每个样本取等量蛋白(约50 μg)进行 SDS-PAGE 凝胶电泳，电压 100 V、100 min。电泳后，电泳凝胶放入半干转膜槽内进行转膜，设定电压为20 V、时间10 min，将蛋白条带转膜至PVDF膜。转膜后，PBS漂洗膜3次，5 min/次。取出膜，放于封闭液(含3%脱脂奶粉和0.3%BSA)中，37 ℃ 封闭 2 h。PBST(含 0.05%Tween 20的PBS)漂洗1次，5 min/次。将膜按照相对分子质量裁成小条，加入多克隆兔/鼠抗 p-Akt、Akt、β-actin抗体(1∶3000)，4℃孵育过夜后用适量PBST漂洗6次，6 min/次。将膜又分别浸入1∶10 000的带HRP标记的羊抗兔/鼠二抗，室温孵育1h后用适量PBST漂洗6次，5 min/次。ECL显色。FluorChem FC2化学发光/荧光/可见光凝胶成像分析系统进行图像采集，并分析图片。采用Image J软件(version 1.41)对条带灰度值进行分析。

1.6 统计学分析 采用SPSS 18.0软件处理数据，Origin 7.5软件进行作图。计量资料用均数±标准差(±s)表示。多组均数比较用单因素方差分析。组间两两比较采用LSD法。以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同浓度ITF对GES-1细胞增殖活力的影响采用CCK-8试剂盒检测不同浓度ITF对GES-1细胞增殖活力的影响。与空白对照组比较，经过ITF处理的GES-1细胞增殖活力显著升高(P＜0.05)，见图1。不同浓度的ITF对GES-1细胞的增殖影响存在差别，促进GES-1细胞增殖的能力随ITF浓度越高而加强。

2.2 Western blot检测 ITF刺激后 PI3K/Akt信号通路的表达情况 采用Western blot技术检测ITF处理GES-1细胞后，PI3K/Akt信号通路中关键蛋白p-Akt、Akt蛋白的表达情况。结果显示，ITF刺激5 min后，与空白对照组比较，p-Akt蛋白表达水平明显上升(P＜0.01);ITF刺激30min左右表达水平达到最高，并可维持高水平表达至60 min;之后表达水平逐渐下降;120 min后p-Akt表达水平降至与空白对照组接近。Akt蛋白表达水平在ITF刺激处理后始终保持不变。见图2。Western blot结果说明ITF通过激活PI3K/Akt信号通路促进GES-1细胞的增殖。

2.3 光镜下观察ITF和LY294002对GES-1细胞增殖的影响 同一密度接种的GES-1细胞经ITF和LY294002处理3 d后显微镜下观察发现，与空白对照组相比较，ITF组明显促进了GES-1细胞的增殖，细胞密度明显增加。而采用PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002处理后，ITF刺激的细胞增殖速度明显减弱，细胞密度较ITF组明显降低。经LY294002单独处理的GES-1细胞增殖速度最慢、密度最低。见图3。实验结果说明PI3K/Akt信号通路参与调控GES-1细胞的增殖。

2.4 PI3K/Akt信号通路对GES-1细胞增殖的调控作用 采用CCK-8试剂盒检测PI3K/Akt信号通路对GES-1细胞增殖活力的影响发现，与空白对照组比较，经过ITF处理的GES-1细胞增殖活力显著升高(P＜0.01);而LY294002能够明显抑制ITF的作用效果，与ITF组相比较，ITF+LY294002组GES-1细胞增殖活力明显下降(P＜0.01)，且随着时间的延长，LY294002的抑制作用越明显，见图4。实验结果说明LY294002通过抑制PI3K/Akt信号通路能够阻断ITF的促增殖作用，PI3K/Akt信号通路是ITF促进GES-1细胞增殖的主要分子机制。

图1 各组细胞不同时间A值比较Figure 1 Comparation of absorbance in each group

图2 Western blot检测ITF刺激GES-1细胞后PI3K/Akt信号通路的表达情况对比Figure 2 Effects of ITF on the PI3K/Akt signaling pathway of GES-1 cells detect by Western blot

图3 GES-1细胞加入ITF和LY294002后光镜下观察GES-1细胞的增殖情况Figure 3 Effects of ITF and LY294002 on the proliferation of GES-1 cells detect by light microscope

2.5 Western blot检测 PI3K/Akt信号通路的表达情况 采用Western blot技术检测ITF和LY294002处理GES-1细胞后，PI3K/Akt信号通路中关键蛋白p-Akt、Akt蛋白的表达情况。ITF刺激后与空白对照组相比较，p-Akt蛋白表达水平显著升高(P＜0.01)，而在加入PI3K抑制剂LY294002处理后，ITF激活的p-Akt表达明显受到抑制(P＜0.01)，其表达水平显著下降，p-Akt表达降至较低水平。见图5。Western blot结果说明ITF通过激活PI3K/Akt信号通路参与调控GES-1细胞的增殖。

图4 不同时间各组GES-1细胞分别加入ITF和LY294002处理增殖活力比较Figure 4 Effects of ITF and LY294002 on the proliferation of GES-1 cells detect by CCK-8

图5 Western blot检测ITF和LY294002分别处理GES-1细胞后PI3K/Akt信号通路的表达比较Figure 5 Effects of ITF and LY294002 on the P13K/Akt signaling pathway of GES-1 cells detect by Western blot

3 讨 论

患者在遭受各类严重创伤(包括大手术)、烧伤、颅脑外伤、危重疾病和其他应激情况下，会出现胃、十二指肠黏膜的急性病变，主要表现为胃、十二指肠黏膜的糜烂、溃疡、渗血、黏膜上皮凋亡脱落等，可导致原有病情恶化［6-7］。胃溃疡的发病机制相当复杂，既与整体因素如神经-内分泌失调有关，又与局部因素如胃黏膜屏障保护功能削弱和损伤因素作用相对增强有关，是多因素综合作用的结果［8-9］。其中，胃黏膜上皮屏障的破坏是胃溃疡发生发展的重要环节。多种因素导致胃溃疡发生时，各类损伤因素会导致胃黏膜上皮组织发生损伤凋亡，使得黏膜上皮屏障功能障碍，继而引发应激性溃疡的发生发展。因此，对胃黏膜上皮组织结构的保护和功能恢复对于治疗应激性溃疡至关重要。如何促进胃黏膜上皮细胞增殖、修复上皮组织完整性并恢复上皮屏障功能是治疗应激性溃疡的关键。

近年多项研究表明，TFF是在胃肠道黏膜病变损伤中对胃肠道黏膜保护作用十分重要的一类蛋白质多肽［10-14］。而作为 TFF家族重要的一员，ITF，因其结构稳定、紧密，具有抗酸、抗蛋白酶和抗热分解的生物学特性，因而在消化道内能保持结构及功能上的完整，逐渐受到研究人员的广泛关注［15］。目前“基因重组TFF3”已被批准为国家一类新药，其治疗适应证为修复黏膜上皮组织、预防与治疗胃肠道溃疡及炎症。有研究报道表明，ITF参与了胃肠道溃疡中黏膜保护、创伤修复［16］、黏膜上皮细胞迁移［17］、细胞凋亡调控［18］和血管生成［19］等重要的生物学过程，发挥对胃肠道的保护作用。本研究探讨了重组ITF对胃黏膜上皮细胞的增殖作用的影响，并探讨其作用的分子机制。实验中，通过CCK-8检测ITF作用胃黏膜上皮细胞GES-1后，增殖活力的变化情况。结果表明，在ITF刺激下，GES-1细胞增殖活力明显增强，且随着ITF浓度的升高，其增殖活力亦越强。随着ITF作用时间的延长，GES-1始终处于增殖状态，增殖活力变化较为明显。然而，目前关于ITF促进胃年膜上皮细胞增殖的分子机制尚缺乏深入研究，ITF作用的具体分子机制尚不十分明确。

研究表明，PI3K/Akt信号通路与细胞的生命活动密切相关，参与调节细胞的凋亡、增生、迁移、分化和代谢［20-21］。除此之外，PI3K/Akt信号通路还参与胃黏膜上皮重建、促进胃部肿瘤的发生发展［22］。研究已证明ITF的抗凋亡作用不是直接作用于凋亡信号分子(如fas、bcl-2)，而是阻断与 EGFR和 PI3K/Akt有关的p53依赖或非依赖的细胞凋亡［23］。另有研究发现，ITF通过PI3K/Akt/NF-κB途径阻断上皮细胞凋亡相关锚定蛋白(anoikis)［24］。而对于ITF促进GES-1细胞的增殖与PI3K/Akt信号通路的相关性研究在本实验中有所体现。Western blot实验结果表明，在ITF刺激GES-1细胞5 min后，Akt蛋白发生磷酸化;刺激30min时达到峰值，随后开始下降;120 min时已恢复正常水平，证明ITF能够激活GES-1细胞的PI3K/Akt信号通路，从而促进胃黏膜上皮细胞的增殖。利用PI3K/Akt信号通路的特异性抑制剂LY294002处理GES-1细胞。结果发现，在LY294002的作用下，通过CCK-8检测发现ITF对GES-1细胞的促增殖作用明显受到了抑制。Western blot结果表明，在LY294002作用后，ITF激活的p-Akt水平表达下降，证明PI3K/Akt信号通路受到抑制。以上结果证明，PI3K/Akt信号通路是参与ITF促进GES-1细胞增殖的主要信号通路。

本研究的实验结果证明，ITF可以通过激活PI3K/Akt信号通路促进胃黏膜上皮细胞的增殖，PI3K/Akt信号通路是ITF发挥促增殖作用的主要分子机制。然而，关于在PI3K/Akt信号通路中相关蛋白的激活情况，以及其他下游参与ITF信号传递的信号通路尚有待进一步研究。

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