糖尿病大鼠创面愈合中巨噬细胞的浸润变化

刘 宸，章宏伟，徐 宁，崔毓桂

0 引 言

随着糖尿病发病率的逐年增高，糖尿病性创面愈合障碍的发生率也在不断上升。在我国，因创面因素入院的患者中糖尿病患者已达36%，占首位［1］。糖尿病是一种慢性炎性反应疾病，其固有免疫炎症细胞的功能障碍涉及全身各个系统［2-3］。糖尿病状态下巨噬细胞的表型和功能均可发生改变，从而导致炎性反应失调引起各种并发症［4-6］。同样，也有研究显示糖尿病性创面常处于异常的炎性反应环境中，并伴有巨噬细胞为主要来源的炎症因子分泌障碍，这提示糖尿病性创面的愈合过程中也存在着失调的巨噬细胞炎性反应［7-8］。本文拟通过观察糖尿病大鼠创面愈合过程中巨噬细胞的浸润数量及炎症因子表达量变化情况，初步探讨其与糖尿病鼠创面愈合障碍间的相关性。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康清洁级SD大鼠，雄性，35只，6～7周龄，体重180～220g，由南京医科大学实验动物中心提供。实验动物许可证号:SCXK(苏)2013-0005。普通饲养环境，室温控制于18～25℃，相对湿度50%，12 h光照12 h黑夜交替。普通颗粒饲料投喂，专人供水，创面造模前每笼5只，创面造模成功后单只单笼饲养。整个实验过程符合实验动物伦理学标准条例，实验人员具备江苏省动物实验从业人员资质。

1.2 主要实验试剂 链脲佐菌素(Sigma公司)，小鼠抗大鼠CD68(Santa Cruz公司)，羊抗大鼠CCR7(Novus公司)，小鼠IgG SABC试剂盒及羊IgG FITCSABC试剂盒(武汉博士德公司)，Trizol、预混反转录试剂盒、SYBR Green Premix试剂盒(Takara公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 糖尿病大鼠模型建立 大鼠经适应性饲养1周后，检测尾静脉随机血糖，血糖异常者剔除［9］。按随机数字表法选取20只大鼠，称重后按55 mg/kg剂量腹腔注射柠檬酸缓冲液(pH 4.2～4.5)稀释的链脲佐菌素，稀释浓度为4 mg/mL。72 h后检测尾静脉随机血糖，血糖值＞16.7 mmol/L者入选，分别于造模1、3、8周后复测尾静脉血糖。血糖持续＞16.7mmol/L达8周者视为糖尿病模型成模鼠入组。建模期间所有大鼠正常饮食，适当供给蛋白质。除外糖尿病造模过程中血糖恢复或因血糖波动死亡鼠，最终入组糖尿病鼠15只。

1.3.2 创面模型建立 糖尿病模型成模鼠为模型组，健康同龄对照鼠为对照组，每组15只，于术前1 d背部备皮，手术当天腹腔注射水合氯醛(30 mg/kg)麻醉。常规消毒大鼠背部后，距大鼠颅后线3 cm背部正中处美兰标记，用手术刀及眼科剪造1 cm2全层皮肤缺损，纱布止血，数码照相后贴膜覆盖，胶布固定包扎。

1.3.3 创面取材 2组在创面形成后第3、7、14天分别按随机数表法各抽取5只大鼠，水合氯醛腹腔麻醉后，数码照相，距创缘外2mm处切取创周及全部创面肉芽组织，行形态学、免疫组织学及分子生物学检测。

1.3.4 创面愈合率 计算公式如下:

创面愈合率=(原始创面面积-未愈合创面面积)/原始创面面积×100%

1.3.5 组织形态学 4%甲醛固定组织，经乙醇梯度脱水后二甲苯透明，石蜡包埋，切5 μm厚切片，再经脱蜡至水，行HE染色，光镜观察创面组织炎症细胞浸润情况。

1.3.6 巨噬细胞标记和计数 创面组织切片脱蜡至水，后续过程依小鼠IgG即用型SABC试剂盒说明书进行，其中一抗为小鼠抗大鼠 CD68 1∶50。DAB显色，中性树胶封片后，显微镜下每张切片随机计数5个高倍视野下CD68+细胞平均数。

1.3.7 创面组织中IL-12B、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、TNF-α 的 mRNA 测定 冻存组织取出后，采用Trizol法抽提出组织总RNA，经预混反转录试剂盒反转录合成cDNA，采用SYBR Green Premix试剂盒进行RT-PCR检测。引物订购自Invitrogen公司，引物序列如下:GUSB上游5'-TGAGAATCAACAGCGCCCAT-3'，下游 5'-CCTCCCTCATGTTCCACCAC-3';IL-12B上游5'-AGAAGTACTCAGTGGCGTGC-3'，下游 5'-GGTGGGTCCGGTTTGATGAT-3';iNOS上游5'-ACACAGTGTCGCTGGTTTGA-3'，下游 5'-AACTCTGCTGTTCTCCGTGG-3';TNF-α 上游 5'-CATCCGTTCTCTACCCAGCC-3'，下 游 5'-AATTCTGAGCCCGGAGTTGG-3';其中 β-葡萄糖苷酸酶(Glucuronidase，Beta Elisa Kit，GUSB)为内参基因，反应条件:95℃ 1min，95℃ 15s、60℃ 1min，共40 个循环，采用2-ΔCT法计算相对表达量。

1.3.8 创面组织CCR7荧光染色 创面组织切片脱蜡至水，后续过程依羊IgG FITC-SABC试剂盒说明书进行，其中一抗为羊抗大鼠 CCR7 1:100。抗荧光淬灭封片剂封固后，倒置荧光显微镜观察高倍视野下CCR7阳性细胞染色情况。

1.4 统计学分析 采用SPSS18.0软件进行统计分析，定量资料以均数±标准差(±s)表示。图像数据采用Image J软件系统处理。两样本间比较采用t检验，指标间采用Pearson直线相关分析，P≤0.05为有统计学意义。

2 结 果

2.1 创面愈合率 在术后第3、7、14天时，模型组的创面愈合率均低于对照组［(29.5±5.4)%vs(45.9 ± 12.8)%、(71.6 ± 3.1)%vs(80.1 ±6.9)%、(93.9 ±2.8)%vs(99.4 ±1.4)%］，差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.2 创面组织HE染色结果 术后第3天时，对照组创面组织中可见明显炎症细胞浸润，而模型组创面组织中的炎症细胞浸润密度较低;2组术后第7天时均有大量炎症细胞浸润;术后第14天时对照组可见炎症细胞浸润密度较第7天时明显降低，而模型组创面中炎症细胞浸润密度变化不明显，且模型组的炎症细胞浸润密度明显高于对照组。见图1。

2.3 创面组织CD68染色结果 术后第3天模型组创面中巨噬细胞数量较对照组少，差异有统计学意义(P＜0.01);术后第7天2组创面内均可见大量巨噬细胞浸润，其中模型病组巨噬细胞浸润密度高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05);术后第14天可见模型组和对照组创面中巨噬细胞浸润密度较各自组第7天均有所下降，但模型组创面中巨噬细胞浸润密度仍明显高于对照组，差异有统计学意义(P ＜0.01)。见图2、图3。

图1 糖尿病大鼠与对照大鼠创面组织炎症细胞浸润情况(HE×200)Figure 1 Infiltration of inflammatory cells in wound tissues between the rats from DM group and control group(HE×200)

图2 糖尿病大鼠与对照大鼠创面组织巨噬细胞浸润密度(免疫组化染色 ×400)Figure 2 Infiltration densities of macrophagocytes between the rats from DM group and control group(IHC×400)

图3 糖尿病大鼠与对照大鼠创面组织CD68+细胞数比较Figure 3 The amount CD68 of positive cells of the wound tissue at different time points

2.4 创面组织中巨噬细胞数和创面愈合率的相关性分析结果 针对本实验2组小鼠，术后第3天时，创面巨噬细胞数和创面愈合率呈正相关(r=0.909，P＜0.01);术后第7天时两者间无相关性(r=-0.135，P ＞0.05);术后第 14 天时两者间呈负相关(r=-0.962，P ＜0.01)。见图4。

2.5 创面组织中炎症因子mRNA的检测结果 第3天时，模型组 IL-12B、iNOS、TNF-α 的 mRNA 表达量均低于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。第7天时模型组IL-12B、iNOS的mRNA表达量较对照组高，差异有统计学意义(P＜0.05)，而TNF-α的mRNA表达量较对照组低，差异有统计学意义(P＜0.05)。而在第 14 天时模型组 IL-12B、iNOS、TNF-α的mRNA表达量均高于对照组，差异有统计学意义(P ＜0.05)。见表1。

图4 创面巨噬细胞浸润密度和创面愈合率的相关性分析Figure 4 Correlation of wound macrophage density with the wound closure rate

表1 创面组织IL-12B、iNOS、TNF-α mRNA相对表达量(±s)Table 1 Relative expression of IL-12B，iNOS，TNF-α in different time points(±s)

表1 创面组织IL-12B、iNOS、TNF-α mRNA相对表达量(±s)Table 1 Relative expression of IL-12B，iNOS，TNF-α in different time points(±s)

分组 n IL-12B mRNA第3天 第7天 第14天mRNA第3天 第7天 第14天iNOS的mRNA第3天 第7天 第14天TNF-α的对照组 5 0.141 ±0.015 0.012 ±0.001 0.028 ±0.001 14.455 ±0.463 0.797 ±0.030 0.029 ±0.004 1.472 ±0.273 0.781 ±0.106 0.643 ±0.122模型组 5 0.055 ±0.015 0.057 ±0.019 0.134 ±0.026 11.206 ±1.897 0.946 ±0.058 0.279 ±0.045 1.023 ±0.038 0.359 ±0.126 1.038 ±0.115 t值 -6.911 4.304 7.157 -2.882 3.941 9.572 -2.814 -4.431 4.084 P 值 0.002 0.049 0.019 0.045 0.017 0.001 0.048 0.011 0.015

2.6 CCR7免疫荧光染色结果 术后第3天时，2组创面内均出现多量阳性染色细胞，而模型组创面组织内阳性染色细胞较对照组稀疏。术后第7天时，2组均有大量阳性染色细胞。术后第14天时，可见模型组创面内仍残留有较多阳性染色细胞，而对照组仅残留极少数阳性染色细胞。见图5。

图5 糖尿病大鼠与对照大鼠创面组织阳性染色细胞比较结果(CCR7荧光染色 ×400)Figure 5 Comparison of positive staining cells in wound tissues between the rats from DM group and control group(×400)

3 讨 论

炎症反应是创面愈合过程中的起始步骤，适度的炎症反应有助于创面的正常愈合［10-11］。作为创面中的主要炎症反应细胞，巨噬细胞对创面愈合过程中炎症反映的调节具有重要意义［12-14］。目前，创面中已知的巨噬细胞可以具有M1型(经典活化型，即促炎症型)和M2型(选择活化型，即促血管型)2种极化状态。其中M1型巨噬细胞具有较强的炎症反应能力，可以合成大量iNOS并分泌大量炎症因子如IL-12、IL-23、TNF-α 等，对创面愈合过程中的炎症反应起调节作用［15-17］。正常情况下，M1巨噬细胞出现在创面愈合的早期，分泌大量的炎症因子和炎症趋化因子，从而促进创面炎症反应，加强创面坏死组织和细胞清除，防止细菌侵袭。在完成炎症反应过程后巨噬细胞在创面局部的浸润密度逐渐降低，残余巨噬细胞也转变为M2型巨噬细胞，同时其炎症因子的表达量逐渐下降，抗炎症因子的分泌增强，从而减轻创面的炎症反应，促进创面的细胞增殖和血管化的形成［18-20］。糖尿病状态下，巨噬细胞表型发生异常，主要表现为M1型巨噬细胞的数量和比例增高［21］，同时其分泌的炎症因子水平上升，但其刺激活化后的炎症因子表达能力和吞噬能力却明显减弱［6，22］。

本实验结果表明糖尿病大鼠创面中的巨噬细胞早期浸润数量较低与创面愈合率具有正相关性，而晚期残留巨噬细胞数量较多且与创面愈合率具有负相关性。同时IL-12、IL-23、iNOS 、TNF-α mRNA 表达量的变化与之基本吻合，其为创面愈合过程中具有代表性的炎症因子，主要由M1巨噬细胞表达分泌，其mRNA表达量的高低反映了巨噬细胞的极化状态及创面炎症反应的强度。本研究选择IL-12B作为评估IL-12和IL-23 mRNA表达量的指标是因为IL-12B(即IL-12p40)是IL-12和IL-23共有的亚基，决定着IL-12和IL-23的合成量，并与炎症的强度密切相关［23］。目前，关于M1型巨噬细胞的表面特异性标记尚未达成共识，本研究选择CCR7作为评估创面M1型巨噬细胞的标记，是因为CCR7在人和动物的M1型巨噬细胞中都具有较好的代表性［24］。然而需注意的是CCR7有时也在淋巴细胞和部分树突状细胞的亚群中有所表达［25］，由于这些细胞在创面愈合中的浸润数量远低于巨噬细胞［26］，所以虽然不能采取定量的方法比较2组创面内M1型巨噬细胞的数量，但结合镜下所见的图像和相关炎症因子的表达情况，依然可以推测出糖尿病创面愈合晚期时仍有多量M1型巨噬细胞残留。Mirza等［27］发现术后第10天时糖尿病创面中仍然留有较多的M1型巨噬细胞，同时伴有生长因子表达量的下降和炎症因子表达量的上升。愈合晚期增强的炎症反应不利于创面的愈合，可以导致创面上皮化的失败和血管化的困难，然而导致糖尿病创面晚期炎症反应增强的原因，目前并不明确。

创面愈合早期适当的炎性反应有助于创面的正常愈合，正常巨噬细胞在吞噬和清除凋亡的组织和细胞后其炎症因子分泌功能下降，逐渐凋亡并被其他巨噬细胞吞噬清除［28］。同时巨噬细胞分泌的部分炎症因子可以有效刺激抗炎症因子的分泌，加速炎症反应的消退，例如IL-12可以经由负反馈机制刺激抗炎症因子IL-10的分泌［29］。而糖尿病状态下的巨噬细胞吞噬速度较正常慢5倍以上［30］，可能导致创面坏死组织及调往细胞清除较慢持续趋化巨噬细胞浸润，同时已趋化至创面的巨噬细胞也无法顺利完成凋亡过程，并且由于炎症因子的分泌功能下降，糖尿病创面不能形成有效的负反馈机制抑制炎症反应，最终导致了愈合后期创面巨噬细胞的浸润增多、炎症反应增强。本实验结果显示第3天时创面巨噬细胞数与创面愈合率呈正相关性，但模型组创面内巨噬细胞明显低于对照组，且炎症反应强度较弱，提示创面内巨噬细胞数量不足，无法完成有效的炎症反应过程，并且由于糖尿病状态下的巨噬细胞吞噬及炎症因子表达功能均受损，更降低了愈合早期的炎症反应效能，导致了后期持续的炎症反应增强。

糖尿病作为一种全身系统性疾病，其创面巨噬细胞的浸润和功能的障碍仅仅是全身病变在局部的表现，患者全身免疫炎症的状态也会对创面的愈合产生不良影响。本实验仅初步证明了STZ诱导的糖尿病大鼠创面模型中巨噬细胞早期浸润密度较低炎症反应强度较低，而晚期持续停留于创面且炎症反应增强，这可能与糖尿病创面愈合障碍有一定的相关性。

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