星点设计-效应面法优化显齿蛇葡萄提取工艺*

苏素娇 谢勇 李娜 杨先锋 梁一池

（福建中医药大学药学院 福州350122）

显齿蛇葡萄系葡萄科蛇葡萄属植物（Ampelopsis grossedentata＜Hand-Mazz＞W.T.Wang），主要分布在福建、广东、湖南等省区。其味甘、淡，性凉，具有清热解毒、利湿消肿等功效，主治黄疸型肝炎、感冒风热、咽喉肿痛、目赤肿痛、痈肿疮疖等[1]。国内采用正交旋转设计或均匀设计来优化显齿蛇葡萄总黄酮的提取工艺，这两种方法采用线性数学模型，具有简便、试验次数少等优点，但精度不高[2～5]。我们以显齿蛇葡萄总黄酮、二氢杨梅素、杨梅苷、杨梅素为评价指标，研究超声提取中乙醇体积分数、提取时间、溶媒比对显齿蛇葡萄各指标的影响，并用星点设计-效应面法优化其提取工艺，为显齿蛇葡萄的有效利用及开发提供实验依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 UV-9100紫外可见分光光度计（北京瑞利分析仪器公司）；THC-10B数控超声波提取器（济宁天华超声电子仪器有限公司）；AR2130电子天平（上海奥豪斯仪器有限公司）；DFYDHG-9240电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；Waters e2695高效液相色谱仪（HPLC）包括四元泵、在线脱气机、自动进样器、柱温箱、2998PDA检测器，Empower3工作站（美国Waters公司）；Sartorius CP225D电子天平（德国Sartorius公司）；Millipore超纯水机（法国Millipore公司）。

1.2 试药 二氢杨梅素对照品（批号：12013108）、杨梅素（批号：12013108）、杨梅苷（批号：12013108），水为重蒸水，其它试剂为分析纯。显齿蛇葡萄药材采于福建省高新技术产业园显齿蛇葡萄基地，由福建中医药大学药学院中药鉴定教研室范世明高级实验师鉴定为葡萄科蛇葡萄属植物显齿蛇葡萄（Ampelopsis grossedentata＜Hand-Mazz＞W.T.Wang）。药材于40℃下干燥至恒重，粉碎过40目筛，备用。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱UltimateXB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）-0.5%甲酸溶液（B）；梯度洗脱，0～50 min，10%～20%A，50～75 min，20%～30%A。流速0.8 mL/min，检测波长365 nm，柱温40℃，进样量 10 μL。

2.2 对照品及供试品溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取二氢杨梅素、杨梅苷、杨梅素对照品适量于10 mL量瓶中，加无水乙醇溶解，稀释至刻度，分别配制成浓度为7.944 mg/mL、1.009 mg/mL和0.997 mg/mL的对照品储备液。精密吸取各对照品储备液适量，用无水乙醇制成每1 mL对照品溶液含二氢杨梅素3.972 mg、杨梅苷0.1009 mg、杨梅素0.0499 mg的混合对照品溶液，放置4℃冰箱储存备用。

2.2.2 供试品溶液的制备 称取显齿蛇葡萄粉末0.5 g，于100 mL锥形瓶中，量取60%的乙醇溶液15 mL，称定重量，浸泡30 min后，超声提取30 min，称重，补足失重。取上层清液1 mL定容至10 mL即得。

2.3 标准曲线绘制

2.3.1 紫外测定总黄酮标准曲线绘制 取对照品溶液 0.6、0.8、1.2、1.4、1.6、2.0 mL 于 25 mL 瓶中，加1%AlCl3溶液4 mL，用30%乙醇溶液定容至刻度，反应10 min，以30%乙醇溶液为空白，在310 nm处测定吸光度值，以对照品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，制备标准曲线，得回归方程：Y=52.92X-0.0026，r=0.9999，结果表明二氢杨梅素在4.84～16.13 μg/mL内具有良好的线性关系。

2.3.2 二氢杨梅素、杨梅苷、杨梅素的标准曲线绘制 精密吸取“2.2.1”项的混合对照品溶液1、2、4、8、12、15 μL，分别按照“2.1”项的色谱条件进样测定，记录色谱图，以进样量（μg）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，建立回归方程，得二氢杨梅素的回归方程为：Y=80532X+44994，r=0.9998；得杨梅苷的回归方程为：Y=2×106X+21700，r=0.9999；得杨梅素的回归方程为：Y=4×106X+12996，r=0.9999；结果表明二氢杨梅素、杨梅苷、杨梅素分别在3.972～59.580 μg、0.101～1.514 μg、0.050～0.748 μg范围内具有良好的线性关系。

2.4 星点设计 在单因素试验考察的基础上，确定超声提取的考察因素为乙醇体积分数、提取时间、溶媒比，进一步采用星点设计-效应面法优化提取工艺，因提取次数为非连续变量，回归处理比较困难，暂定为1次。根据星点设计的原理，每个因素设5个水平，用代码 -α、-1、0、1、α 来表示（3 因素星点设计的α=1.682），代码所代表的实际操作物理量见表1，星点实验设计及结果见表2。

表1 星点设计实验因素水平

表2 星点实验设计及结果 mg/g

2.5 模型拟合 应用Design-Expert8.0.4软件对所得数据进行效应面试验分析，以总黄酮、二氢杨梅素、杨梅苷、杨梅素四者的总体归一值（OD）为评价指标[6]，分别对各因素进行多元线性回归及二项式方程拟合。多元线性回归方程：OD=0.69+0.16A+0.19B+0.002C（r=0.6273）；二项式拟合方程：OD=0.85+0.16A+0.19B+0.002C-0.09AB+0.03AC+0.05 BC-0.103A2-0.09B2-0.04C2（r=0.8822）。从拟合方程的相关系数可见，多元线性回归方程的相关系数较低（r=0.6273），表示自变量与因变量之间线性相关性较差，多元线性回归拟合度不佳，预测性较差，因此该数学模型不合适。多元二项式拟合方程相关系数较高，拟合效果较好。方程从整体上反映了各因素及其相互作用对指标值的影响。

2.6 方差分析 采用ANOVA分析效应面的回归参数，由表3可知一次项A、B极显著，C显著，二次项A、B极显著水平，交互项等其余项均不显著，说明各个具体试验因素与响应值都不是简单的线性关系。此外，还可以看出各因素对OD值影响的大小顺序为：溶媒比（B）＞乙醇浓度（A）＞提取时间（C）。本试验选用的模型极显著（P＜0.01），失拟项不显著（P＞0.05），说明未知因素对实验结果干扰很小，二项式拟合模型为成功模型，实测值与预测值基本吻合，有较好的预测作用。

表3 拟合回归方程的方差分析

2.7 工艺条件优化与预测 根据二次多项式模型，绘制各考察因素与总体归一值（OD）之间的等高线图与三维效应曲面图。根据各因素水平设定各因素自变量区间，效应值选择极大值，得到最佳提取工艺条件：乙醇体积分数65.82%，溶媒倍量33.88倍，提取时间32.61 min，此时OD有最大预测值0.9814。考虑到实际生产情况，将各因素条件取整确定显齿蛇葡萄总黄酮最佳提取工艺条件：30倍量65%乙醇超声提取1次，提取时间为30 min。

2.8 验证试验 按上述优化后的最佳工艺条件提取并测定显齿蛇葡萄中总黄酮、二氢杨梅素、杨梅苷、杨梅素的含量，并且进行总体归一化处理，得到平均OD值为0.9762，RSD为1.67%，预测值为0.9814。结果表明，所建立的数学模型具有良好的预测性，所选工艺条件重现性好。

3 讨论

本实验采用超声提取法提取显齿蛇葡萄总黄酮、二氢杨梅素、杨梅苷、杨梅素，结果表明：最佳提取工艺条件为30倍量65%乙醇超声提取1次，提取时间为30 min。此条件下，得到各指标成分的含量经总体归一化处理后得到的的OD值为0.9762。采用非线性拟合的星点设计-效应面法拟合得出最佳条件，可以很好地解决传统正交设计的不足，从而提高优化效果。此法与传统方法相比较，具有节约、操作简单、省时等优点，得率也高，在中药提取中具有良好的应用前景。

[1]国家中医药管理局编委会.中华本草[M].第13卷.上海：上海科学技术出版社，1998.4 229

[2]陈业，罗祖友，向东山.藤茶黄酮类化合物的提取分离与定量方法研究进展[J].湖北民族学院学报(自然科学版)，2008，26(3)：277-281

[3]刚振坤，马英丽，吴伦，等.星点设计-效应面法优化北五味子果实提取工艺[J].中国实验方剂学杂志，2011，17(23)：28-31

[4]刘艳杰，项荣武.星点设计效应面法在药学试验设计中的应用[J].中国现代应用药学杂志，2007，24(6)：455-457

[5]吴伟，崔光华，陆彬.实验设计中多指标的优化：星点设计和总评"归一值 " 的应用[J].中国药学杂志，2000，35(8)：530-533

[6]卢君蓉，傅超美，刘芳，等.星点设计-效应面法优选丹参中丹参总酚酸的提取工艺[J].中成药，2012，34(7)：1 373-1 376