穿山龙提取物薯蓣皂苷对糖尿病模型大鼠血清HA和5-HT的影响

冷锦红 邱 狮 董佳妮 张 兰 李文金 于世家 侯 平

（辽宁中医药大学附属医院，辽宁沈阳110032）

穿山龙提取物薯蓣皂苷对糖尿病模型大鼠血清HA和5-HT的影响

冷锦红 邱 狮 董佳妮 张 兰 李文金 于世家 侯 平

（辽宁中医药大学附属医院，辽宁沈阳110032）

目的：探讨中药穿山龙提取物薯蓣皂苷对糖尿病大鼠血清组胺（HA）和5-羟色胺（5-HT）的影响，以期为后期痛性糖尿病周围神经病变（DPN）的研究奠定理论基础。方法：以2%链脲佐霉素溶液诱发糖尿病，将造模成功的大鼠，随机分为干预2周、4周、8周的模型组、薯蓣皂苷组和强的松组，另取24只血糖正常的大鼠分为各时期正常组，分别灌胃相应药物或生理盐水后用Elisa法观察不同时期各组大鼠血清HA和5-HT的蛋白表达。结果：模型组治疗各时期血清HA和5-HT表达均明显高于正常组（P＜0.01），薯蓣皂苷组和强的松组大鼠治疗各时期上述指标明显低于模型组（P＜0.01），其中薯蓣皂苷组干预效果明显高于强的松组（P＜0.01）。结论：中药穿山龙提取物薯蓣皂苷可改善糖尿病（DM）大鼠血清致痛物质的表达，疗效强于强的松。

糖尿病 穿山龙 植物提取物 薯蓣皂苷 HA 5-HT 大鼠 实验研究

目前约有四分之一糖尿病患者存在痛性糖尿病周围神经病变（DPN），防治DPN的研究已成为糖尿病临床研究所面临的重要课题。近年来的研究发现，在神经痛的病理状态下，末梢感受器、背根神经节及轴突损伤区有多种物质的变化，致痛物质等都有不同程度的上调或下调。中药穿山龙的有效成分主要为甾体皂苷类，包括薯蓣皂苷、纤细皂苷和水溶性皂苷，其中薯蓣皂苷含量较多[1-3]。研究表明，薯蓣皂苷具有抗炎、镇痛、调节免疫等作用，其对糖尿病周围神经病变的防治作用也日益受到关注。本研究应用现代分子生物学技术探讨薯蓣皂苷对糖尿病模型大鼠血清组胺（HA）和5-羟色胺（5-HT）蛋白表达的影响，以期为后期痛性糖尿病周围神经病变的研究奠定理论基础。

1 实验材料

1.1 实验动物 健康雄性清洁级Wistar大鼠120只，体重范围为200～250g，由辽宁省长生生物技术有限公司提供，许可证号:SCXK（辽2010-0001）。

1.2 试剂与仪器 链脲佐霉素 （美国sigma公司，批号:S-0130）；薯蓣皂苷（陕西慈缘生物技术有限公司，批号:CY140607）；强的松（天津力生制药股份有限公司，批号:201402005）；酶标仪（TECAN中国有限公司）；稳步型血糖仪（美国强生公司）。

2 实验方法

2.1 分组与造模 大鼠适应性喂养1周后，采用随机数字表方法分为正常组24只和造模组96只。造模组大鼠在造模之前禁食12h，腹腔内单次注射2%链脲佐霉素溶液53mg/kg（由0.1mol/L的pH4.2枸橼酸缓冲液配制）诱发糖尿病模型。72h后通过血糖仪测定大鼠尾静脉血的血糖，血糖大于16.7mmol/L者可列入观察的对象[4]。正常组24只大鼠禁食12h之后一次性腹腔内注射相等容积的0.1mol/L枸橼酸缓冲液。实验期间全部大鼠予普通饲料喂养，可自由进食和饮水[5]。将正常组24只大鼠随机分为3组，分别为2周、4周、8周正常组，每组8只。96只造模组大鼠中，4只造模未成功，2只死亡。将造模成功的90只大鼠随机分为2周、4周、8周模型组、薯蓣皂苷组和强的松组，每组10只。

2.2 给药方法 正常组与模型组予生理盐水10mL/（kg·d）灌胃；薯蓣皂苷组予36.18mg/（kg·d）薯蓣皂苷溶液灌胃，剂量参照“实验动物与人按体表面积等效剂量换算比率表”确定[6]；强的松组予1.35mg/（kg·d）强的松灌胃。各组大鼠均于造模成功后开始给药，每日给药1次至各组实验结束（2周、4周、8周）。

2.3 检测指标

2.3.1 血糖情况 分别于治疗后的2周、4周、8周和治疗前（0周）尾静脉取血，用血糖仪测定血糖。

2.3.2 Elisa方法检测各组大鼠血清致痛物质 5-HT、HA表达 各组大鼠治疗结束后腹腔内注射20%乌拉坦（0.4mL/100g）麻醉，腹主动脉取血约5mL，离心取上清待Elisa检测用。Elisa检测方法:①包被，②加样，③配液，④洗涤，⑤加底物液显色，⑥终止反应，⑦判定结果[在450nm波长处，检测各孔的吸光度（OD值），测定需在加终止液后的10min以内进行]。

2.4 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行统计分析。数据用（±s）表示，进行正态性检验，非正态的资料可进行数据的转化。多组间比较用单因素方差分析，方差不齐时用Dunnett’C进行两两的组间比较，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 各组大鼠治疗各时期血糖比较 造模之后模型组、各给药组大鼠血糖水平均明显高于同时期正常组（P＜0.01）；各给药组各时期血糖水平与同期模型组比较无统计学差异（P＞0.05）。见表1。

3.2 各组大鼠血清致痛物质5-HT、HA蛋白表达比较 模型组与各给药组各时期5-HT、HA蛋白表达均明显高于正常组（P＜0.01），提示痛性DM模型造模成功；薯蓣皂苷组、强的松组给药各时期5-HT、HA蛋白表达明显低于模型组（P＜0.01），说明治疗有效，而此2组中薯蓣皂苷组各时期对2指标的改善明显优于强的松组（P＜0.01）。见表2。

4 讨论

有评估显示，中国有25年以上病史的糖尿病患者中，有50%会发展到神经性疼痛。因此，痛性糖尿病神经病变已成为临床顽疾之一，防治本病已成为糖尿病工作者面临的重要课题。强的松是短效糖皮质激素，在抑制免疫、抗炎镇痛方面在临床广泛应用，但是其副作用使得患者依从困难。

疼痛与神经递质、细胞因子的关系极为密切。当疼痛发生时，受损组织便向细胞外液中释放内源性的化学物质，我们称之为致痛物质，包括HA、5-HT、P物质等，其中HA和5-HT是单胺类化合物，是体内存在的一种很强的致痛物质，在局部血液循环障碍引起疼痛的情况下，致痛物质的表达明显上升，同时会引起血管活性物质功能增强，血管通透性增强。

穿山龙为薯蓣科薯蓣属植物穿龙薯蓣的根茎，以地下的根状茎入药，中医学认为其具有祛风止痛、活血舒筋等功效，应用历史悠久，用于治疗风寒湿痹、跌打损伤、腰腿疼痛和筋骨麻木等。穿山龙的有效成分主要为甾体皂苷类，总皂苷酸水解产生薯蓣皂苷元[7-8]，甾体类药物对免疫功能具有广泛的作用，作为具有类似结构的薯蓣皂苷元，同样具有广泛的免疫调节和镇痛抗炎的作用。

本研究结果表明，薯蓣皂苷和强的松均可明显减少糖尿病模型大鼠血清中致痛物质的表达，薯蓣皂苷疗效强于强的松，且随着疗程的延长疗效更加明显。目前单味中药对痛性糖尿病神经病变的研究尚不多见，本研究揭示了单味中药穿山龙提取物薯蓣皂苷可有效减少痛性物质表达，疗效确切，副作用少，作用多靶点，可为临床选择最佳治疗用药提供深层次的理论基础。同时，痛性DM大鼠模型的成功建立，将为痛性DPN模型的成功建立提供依据。在离子通道功能障碍理论的指导下，我们将进一步探讨薯蓣皂苷对痛性DPN大鼠坐骨神经离子通道蛋白表达的影响，为薯蓣皂苷治疗痛性DPN提供深层次的理论基础，同时完善痛性DPN的发病机制研究。

表1 各组大鼠治疗各时期血糖比较（±s） mmol/L

表1 各组大鼠治疗各时期血糖比较（±s） mmol/L

注：与同期正常组比较，▲P＜0.01。

2周0周（治疗前）动物数4周8周（只） 血糖 动物数（只）正常组组别动物数（只） 血糖24 5.88±0.58 248 5.99±0.35 30 23.26±5.32▲30 5.7±0.38血糖 动物数（只）16血糖5.86±0.17模型组 24.58±2.94▲20 20.45±2.83▲10 21.59±4.33▲薯蓣皂苷组 30 23.33±4.31▲30 21.72±2.21▲20 19.27±0.68▲10 20.29±2.61▲强的松组 30 22.71±5.09▲30 25.62±4.32▲20 21.7±2.46▲10 20.69±4.13▲

表2 各组大鼠血清5-HT、HA蛋白表达比较（±s）

表2 各组大鼠血清5-HT、HA蛋白表达比较（±s）

注：与同期正常组比较，▲P＜0.01；与同期模型组比较，★P＜0.01；与同期强的松组比较，△P＜0.01。

组别 时间 动物数（只）2周组 8 5-HT HA 150.87±3.83 289.18±11.97正常组4周组8周组8 8 154.09±2.29 153.32±4.10 10 10模型组2周组4周组277.07±4.25 276.33±3.74 760.29±20.27▲629.70±32.66▲1430.33±57.68▲1400.28±35.48▲8周组 10 2周组 10 363.19±10.31▲★△847.05±26.56▲★△4周组 10 292.91±14.03▲★△540.45±21.42▲★△薯蓣皂苷组8周组 10 270.53±2.87▲★△500.77±30.10▲★△590.36±42.90▲1432.79±50.19▲强的松组2周组 10 427.35±77.67▲★895.8±49.49▲★4周组 10 365.36±34.82▲★674.27±50.79▲★8周组 10 356.62±11.30▲★645.05±23.65▲★

[1] 都述虎，刘文英，付铁军，等.穿龙薯蓣总皂苷中甾体皂苷的分离与鉴定.药学学报，2002，37（4）：267

[2] 姚丽，刘树民.中药穿山龙新的药理作用及其有效部位的实验研究.中华中医药学刊，2010，28（9）：1979

[3] 刁兴彬，高文学，张芳，等.穿山龙提取物质量标准研究.中国药事，2014，28（8）：871

[4] 冷锦红.不同通络中药对糖尿病大鼠周围神经病变的保护作用及其机制研究.沈阳：辽宁中医药大学：2008

[5] Sally.A Price，Sithiporn Agthong，etc.Mitogen-Activated Protein Kinase p38 Mediates Reduced Nerve Conduction Velocity in Experimental Diabetic Neuropathy.Diabetes，2004，7（53）：1851

[6] 陈奇.中药药理研究方法学.北京：人民卫生出版社，1993：50

[7] 丁小林，李卿.中药穿山龙的研究进展.重庆中草药研究，2003（2）：55

[8] 李长辉.益气活血化瘀法治疗痛性糖尿病周围神经病疗效机制的研究.沈阳：辽宁中医药大学，2013

R587.1

A

1672-397X（2015）08-0076-03

冷锦红（1974—），女，医学博士，副主任医师，内分泌学专业。

侯平，医学博士，主任医师，硕士研究生导师。1577292550@qq.com

2015-04-30

编辑：吴 宁

辽宁省科技厅科学技术计划项目（2013226012）；沈阳市科学技术项目计划项目（F13-221-9-55）