窦房结细胞起搏与超极化激活的环核苷酸门控通道关系的研究进展

刘金凤，彭 杰，汪艳丽，刘如秀

·综述与进展·

窦房结细胞起搏与超极化激活的环核苷酸门控通道关系的研究进展

刘金凤，彭 杰，汪艳丽，刘如秀

窦房结是正常心脏活动的起搏点，窦房结细胞的自律性决定心率的快慢，而窦房结细胞4期自动除极是其产生自律性的基础，该过程是通过窦房结细胞膜上多种离子流的共同作用而实现的，其中超极化激活的环核苷酸门控阳离子通道(HCN)及其产生的电流(If电流)在窦房结细胞起搏电活动中具有重要作用。本文探讨窦房结细胞起搏与超极化激活的环核苷酸门控通道的关系，为临床治疗病态窦房结综合征等缓慢性心律失常提供新的方向。

窦房结细胞；超极化激活的环核苷酸门控阳离子通道；起搏电流

窦房结(sino-atrial node，SAN)是正常心脏活动的起搏点，在心脏传导系统中自律性最高，决定了心率的快慢，其病变直接表现为心电生理功能的异常。窦房结细胞(sino-atrialnode cells，SNC)是窦房结产生电生理活动的基础，窦房结细胞起搏有多种离子通道及相应电流参与，其中超极化激活的环核苷酸门控阳离子通道(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide gated cation channel，HCN)及其产生的电流(If)在窦房结细胞起搏电活动中起着重要作用。

1 窦房结与窦房结细胞起搏电生理

窦房结位于右房和上下腔静脉的交界部位(界嵴)以及上下腔静脉之间的区域，其生理功能主要是控制并维持心率在一个稳定的水平。窦房结血供由窦房结动脉供应，该动脉55%～60%来自右冠状动脉的右房前动脉供血，40%～45%来自左冠状动脉回旋支的左房前动脉供血。窦房结内结构不均匀，结内的心肌细胞由中心向周边依次分布P细胞(pale/pacemaker细胞或起搏细胞)、T细胞(transitional细胞或过渡细胞)和心房肌细胞，其中P细胞在窦房结起搏活动中占有重要地位，P细胞自发性舒张期除极的特点形成窦房结的自律性；而从P细胞到心房肌细胞的传导是通过T细胞完成的。

窦房结组织的非均一性使得窦房结中心与周边细胞形态各异，其电生理特性也存在很大差异。对兔 SAN 的研究证明了从窦房结中央到心房边缘的电生理特征的异质性，表现在动作电位形态上的逐渐改变、最大舒张电位的降低、超射峰值的增加、上升速率的增加和起搏点位斜率的降低[1，2]。可能正是由于窦房结组织结构的复杂性和功能的的异质性，才保证了窦房结的正常工作。

随着年龄的增长，窦房结结构改变如胶原沉积、肿胀、细胞的肥大和细胞外基质的重塑，离子通道及细胞间连接的改变等，均可以导致窦房结起搏功能下降，从而使得病态窦房结综合征(sick sinus syndrome，SSS)的发病率明显上升[3，4]。老年人窦房结功能障碍的主要表现为窦房结恢复时间的延长和固有心率的降低，其电生理基础是窦房结细胞舒张期去极化程度的降低和动作电位时程的延长[5]。此外，窦房结组织缺血缺氧也是窦房结心电生理功能异常的重要因素，如冠心病心肌缺血时，窦房结发生部分凋亡甚至坏死，使得心肌起搏细胞数量减少，进而出现窦房结结构和功能的减退[6]。

窦房结的电生理功能归功于窦房结起搏细胞的独特电生理特性，以产生不同于周围心房肌细胞的自发性动作电位，电冲动再通过心房，快速传递到房室结，最后在心室肌细胞引起兴奋-收缩偶联反应。在心脏的舒张期，心房肌及心室肌细胞不发生电冲动而维持在较高的超极化水平。但与之不同，自发搏动的窦房结细胞于舒张期存在缓慢的去极化过程，在动作电位的终点，细胞膜电位并不维持在一个更负的水平，而是以一定斜率缓慢地去极化，直到达到一次新冲动的阈电位，引发下一次的动作电位[7]。

窦房结细胞4期自动除极是窦房结产生自律性的基础，因此是窦房结起搏活动的关键，该过程叫做舒张期去极化，是通过SNC细胞膜上多种离子流的共同作用而实现的。窦房结起搏机制从在体电生理到细胞电生理研究已经历经40余年，但目前仍未明确。经典的电生理理论认为，窦房结细胞4 期自动除极的主要机制是：超极化激活环核苷酸门控阳离子电流(起搏电流，简称If) 的激活、延迟整流性钾电流(Ik)的失活以及L型钙电流(ICa-L)和T型钙电流(ICa-T) 的激活等[8]。窦房结细胞动作电位(电兴奋)的产生与细胞膜上的各种离子通道直接相关，其中最重要的是与起搏电流有关的If通道，它决定最大舒张期电位，参与窦房结细胞舒张早期自动化除极后1/3 相，其分子基础是超极化激活的环核苷酸门控(HCN) 通道，而Ik参与SNC动作电位舒张早期自动化除极前1/3相，电压依赖性ICa-L参与舒张早期自动化除极中1/3相[9]。Schulze-Bahr等[10]报道了由于 HCN4 通道在第 573 个氨基酸残基以后缺失的突变，而导致的 SAN 活动异常，HCN4是刺激交感神经调节起搏点活动的主要通道。

2 窦房结细胞主要起搏离子流If电流

早在1980年，Brown等[11]在研究兔窦房结细胞时发现了一种超极化激活的离子电流，并将其命名为If(funny current)电流，又称In电流，该电流在膜电位超极化时激活，后经证实If / In 是参与窦房结起搏活动的重要起搏电流之一。

If电流由超极化激活阳离子通道的HCN 基因家族编码，是窦房结细胞4 期自动除极的主要离子流，是细胞自律性的基础。If电流是非特异性Na+、K+混合内向电流，主要离子成分为Na+，有少量K+参与。在窦房结，If电流可以重复的使起搏点电位从-70 mV向-40 mV去极化，最终导致动作电位的发生[12]。

If电流呈电压依赖性，但与其他大多数电压依赖性通道在去极化激活不同，If在细胞膜超极化至 -50 mV～-70 mV 时激活，至-100 mV 时完全激活，翻转电位为-2 mV±2 mV ，随超极化的加强，If电流变大。该电流激活下存在两种不同动力学成分，一种是小的瞬时内向电流，它能在几毫秒时间内完全激活，一种是大的缓慢激活成分，其完全激活达到稳定状态时需要数百毫秒至数秒钟的时间[13]。

If电流的第2个特性是环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)调控性。激素和神经递质可以升高细胞内的cAMP水平，使得HCN电流的半数激活电位移向较正电位并加快了通道的动力学特性[14]，因此交感神经刺激和迷走张力通过cAMP 介导的If电流加快或减慢心率，If电流也被认为是机体应对肾上腺素刺激时窦性心率加速的重要机制。当β受体兴奋，可通过Gas直接作用，增加If 的幅度，也可通过Gas/cAMP 的间接作用增加If 电流[15]。受体在与儿茶酚胺类物质结合后激活cAMP，提高细胞内cAMP 浓度，If 激活曲线的正向移动，超极化过程中的离子通道开放概率提高，产生一个更大的If 离子流来驱动舒张期去极化的过程，使去极化本身加速来提高自律性。相反，毒蕈碱样乙酰胆碱受体兴奋降低cAMP 的水平和减少If，使心率减缓。

3 If电流相关离子通道

1998年，Santoro等[16]和Ludwig等[17]首次发现了介导超极化激活阳离子电流的离子通道(HCN通道)，并在此后的两年间陆续克隆出多种HCN通道，而编码该通道的基因则被称为HCN基因。

HCN基因的编码产物HCN 通道均是由4个亚单位组装而成的四聚体复合物，每个亚单位含有1个氨基端片段、6个跨膜片段(S1～S6)、1个C 末端环核苷酸结合结构域(cyclic nucleotide-binding domain，CNBD) 和1个羧基端片段，且各种HCN通道异构型在跨膜片段和CNBD区是高度保守的，而在氨基末端和羧基末端的区域差异很大[18]。同时，HCN通道和电压门控的K+通道及环腺苷酸门控通道在基因序列上有很高的同源性。

在对哺乳动物的研究中发现HCN家族有4种基因亚型的表达：HCN1-4。其中在心脏中表达的亚型主要是HCN1、HCN2和HCN4，而窦房结中含量最高的亚型则是HCN4，兔窦房结HCN4可占HCN mRNA表达的4/5[19，20]。总的来说，HCN4 表达在传导系统中具有自发活动的细胞上，能使起搏的频率维持在一定水平以上并随着机体不同的生理状态而对频率进行调整，而HCN2 基本表达在非自发活动的心肌细胞中，主要作用在于维持起搏节律的稳定。通道激活动力学研究发现，HCN4激活最慢，但对cAMP反应性灵敏。组成HCN 通道的4个亚基可以相同或不同。Stieber 等[21]通过对部分心肌组织中2 种亚型对起搏通道的贡献进行研究，认为起搏通道由单独的HCN2或HCN4亚型组成，即起搏通道的同源构成学说，但也有报道起搏通道由HCN2和HCN4共同组成，为起搏通道的异源构成学说。

HCN4基因在窦房结起搏细胞的自发电活动中起着主要的作用，而且对心脏传导系统的功能发育也起着非常重要的作用。HCN4 基因敲除小鼠模型研究证实HCN4 基因在动物胚胎发育过程中起至关重要的作用，HCN4 功能缺失小鼠在胚胎期就终止了生长发育[22]。Stieber 等[12]通过敲除小鼠HCN2、HCN4 基因及应用If 阻滞剂研究HCN 通道与窦房结心律失常的关系。实验表明，HCN4 敲除小鼠心率明显减慢，无心律不齐，无明显的结构异常，但收缩比正常小鼠减小40%，且cAMP 的应用不能扭转减少。动作电位记录提示HCN4 敲除小鼠仅能形成“原始”的动作电位而不能形成“成熟”的起搏电流。Yasui等[23]研究发现，早期的心室肌细胞可以产生自发搏动，这时心肌组织表达HCN4 及HCN1 亚型，到出生后1 d 的心肌细胞在大多数情况下已经失去了自发搏动的能力，HCN2 成为了主要的亚型。随着心室肌细胞中HCN mRNA 表达亚型的变化，总的mRNA 水平也下降了80%，同时If电流密度也相应减少。总之，HCN4 是正常起搏电流产生的重要因素，也是基本心率的决定因素，其具有特征性的表达模式和缓慢门控作用，参与控制心脏起搏细胞的节律性活动。

HCN4通道的调控依赖于cAMP的门控机制为人们所熟知，它由20世纪90 年代早期意大利学者DiFrancesco 等[24]在窦房结细胞的膜片上记录的电流实验中首次揭示。进一步研究发现，HCN通道是由cAMP 经由PKA 介导的丝氨酸/苏氨酸磷酸化作用[25]，证实了PKA 介导的HCN通道磷酸化过程[26]。过去部分学者认为HCN 通道是由cAMP 结合到通道COOH 末端的环核苷酸结合域(CNBD)上从而激活通道，并不依赖磷酸化作用[27]。然而最新研究发现If 兴奋调节中需要PKA的活性，PKA 能直接磷酸化HCN4，If被认为是窦房结细胞cAMP信号的末端效应和作用靶点[28，29]。目前HCN 通道由cAMP调节的分子机制正在进一步研究中。

4 超极化激活的环核苷酸门控通道异常与心律失常

大量研究表明，HCN4通道异常与遗传性心律失常的发生发展关系密切，几种严重的家族性心律失常如长QT 综合征(LQTS)、短QT 综合征(SQTS)、Brugada 综合征、儿茶酚胺敏感性多源性室性心动过速(CPVT)、窦房结及房室结传导系统紊乱、婴幼儿及青少年猝死综合征[30]已经定义为离子通道病。这些心律失常涉及不同的HCN 基因突变，同时表现各异。

Ueda 等[31]分析了6 例窦房结功能障碍患者，3例进展性心脏传导阻滞患者和14例自发性的心室颤动患者的HCN4基因，发现这些患者6个已知的离子通道出现阴性突变，导致HCN4 通道运输障碍，出现膜表达下降和If 减低。Laish等[32]一项关于HCN4基因突变导致晕厥及心动过缓等临床表现研究发现，3个无血亲关系的家系出现HCN4 基因突变，将此突变通道表达在爪蟾卵母细胞及HEK293 细胞上发现起搏电流功能异常及通道蛋白表达下降。Alig等[33]在小鼠中表达人HCN4 基因，发现人HCN4 基因突变导致If 对cAMP 敏感性下降，细胞舒张期除极速度减慢，心率明显降低。总之，HCN4 相关离子通道病基因及功能研究说明，功能缺失突变所致HCN 电流抑制与心脏节律紊乱，尤其是心动过缓相关。

窦房结细胞HCN4 表达的异常与窦房结功能紊乱密切相关。某些心律失常的发生可能与窦房结急性缺血/再灌注损伤后，窦房结细胞HCN4基因表达减低，导致其主导的起搏电流If 异常有关。刘如秀等[34]研究甲醛渗透造成窦房结组织损伤对在体兔窦房结细胞的影响，结果发现窦房结损伤使窦房结细胞HCN4蛋白表达量下降，心率变慢，而益阳活血中药可以上调HCN4蛋白表达从而提高心率。

综上所述，生理状态下HCN4通道相关电流If是产生心脏节律的重要因素，If 的失衡可能是各种心律失常发生的电生理基础之一，而PKA信号转导通路相关的HCN4通道蛋白磷酸化可能是关键的分子机制。通过上调起搏电流If，可提高窦房结细胞自律性，以缓解缓慢性心律失常。进一步研究重点是是如何增加HCN4基因的蛋白表达，提高If，最终增加心率，为临床治疗病窦综合征等缓慢性心律失常提供新的方向。

[1] Bleeker WK，Mackaay AJ，Masson-Pevet M，et al．Functional and morphological organization of the rabbit sinus node[J]．Circ Res，1980，46：11.

[2] Boyett MR，Honjo H，Yamamoto M，et al．Downward gradient in action potential duration along conduction path in and around the sinoatrial node[J]．Am J Physiol，1999，276：H686.

[3] Rose RA．Keeping the clocks ticking as we age：Changes in sinoatrial node gene expression and function in the ageing heart[J]．Exp Physiol，2011，96：1114.

[4] Yanni J，Tellez JO，Sutyagin PV，et al．Structural remodelling of thesinoatrial node in obese old rats[J]．J Mol Cell Cardiol，2010，48：653.

[5] Tellez JO，Mc Zewski M，Yanni J，et al．Ageing-dependent remodelling of ion channel and Ca2+clock genes underlying sino-atrial node pacemaking[J]．Exp Physiol，2011，96(11)：1163-1178.

[6] Victor A，Loren A．Diagnosis and treatment of sick sinus syndrome[J]．American Family Physician，2003，67(8)：1725-1732.

[7] DiFrancesco D．Pacemaker mechanisms in cardiac tissue[J]．Annu Rev Physiol，1993，55：455-472．

[8] Lakatta EG，Maltsev VA，Vinogradova TM．A coupled system of in-tracellular Ca2+clocks and surface membrane voltage clocks controls the timekeeping mechanism of the heart’s pacemaker[J]．Circ Res，2010，106：659.

[9] Irisawa H，Brown HF，Gile W．Cardiac pacemaking in the sinoatrial node[J]．Physiol Rev，1993，73(1)：197-227.

[10] Schulze-Bahr E，Neu A，Friederich P，et al．Pacemaker channel dysfunction in a patient with sinus node disease[J]．J Clin Invest，2003，111：1537.

[11] Brown H，Difrancesco D．Voltage-clamp investigations of membrane currents underlying pace-maker ctivity in rabbit sino-atrial node [J]．J Physiol，1980，308：331.

[12] Stieber J，Hofmann F，Ludwig A，et al．Pacemaker channels and sinus node arrhythmia [J]．Trends Cardiovasc Med，2004，14(1)：23-28．

[13] Robinson RB，Siegelbaum SA．Hyperpolarization-activatedcation currents：From molecules to physiological function [J]．Annu Rev Physiol，2003，65：453-480.

[14] Wainger BJ，DeGennaro M，Santoro B，et al．Molecular mechanism of cAMP modulation of HCN pacemaker channels[J]．Nature，2001，411(6839)：805-810．

[15] Varghese A，Tenbroek EM，Coles J Jr，et al．Endogenous channels in HEK cells and potential roles in HCN ionic current measurements[J]．Prog Biophys Mol Biol，2006 ，90(1-3)：26-37.

[16] Santoro B，Liu DT，Yao H，et al．Identification of a gene encoding a hyperpolarization-activated pacemaker channel of brain[J]．Cell，1998，93(5)：7175.

[17] Ludwig A，Zong X，Jeglitsch M，et al．A family of hyperpolarization-activated mammalian cation channels[J]．Nature，1998，393(6685)：587.

[18] Biel M，Schneider A，Wahl C．Cardiac HCN channels：Structure，function，and modulation [ J ]．Trends Cardiovasc Med，2002，12(5)：206-212．

[19] Marionneau C，Couette B，Liu J，et al．Specific pattern of ionic channel gene expression associated with pacemaker activity in the mouse heart[J]．J Physiol，2005，562(Pt 1)：223.

[20] Shi W，Wymore R，Yu H，et al．Distribution and prevalence of hyperpolarization-activated cation channel (HCN) mRNA expression in cardiac tissues[J]．Circ Res，1999，85(1)：e1.

[21] Stieber J，Herrmann S，Feil S，et al．The hyperpolarization-activated channel HCN4 is required for the generation of pacemaker action potentials in the embryonic heart[J]．Proc Natl Acad Sci USA，2003，100(25)：15235.

[22] Nof E，Antzelevitch C，Glikson M．The contribution of HCN4 to normal sinus node function in humans and animal models[J]．Pacing Clin Electrophysiol，2010，33(1)：100.

[23] Yasui K，Liu W，Opthof T，et al．I(f) current and spontaneous activity in mouse embryonic ventricular myocytes[J]．Circ Res，2001，88(5)：536-542．

[24] DiFrancesco D，Tortora P．Direct activation of cardiac pacemaker channels by intracellular cyclic AMP[J]．Nature，1991，351(6322)：145-147．

[25] Schulz DJ，Temporal S，Barry DM，et al．Mechanisms of voltage-gated ion channel regulation：From gene expression to localization[J]．Cell Mol Life Sci，2008，65(14)：2215-2231．

[26] Vargas G，Lucero MT．Modulation by PKA of the hyperpolarization-activated current (Ih) in cultured rat olfactory receptor neurons[J]．J Membr Biol，2002，188(2)：115-125．

[27] Zagotta WN，Olivier NB，Black KD，et al．Structural basis for modulation and agonist specificity of HCN pacemaker channels[J]．Nature，2003，425(6954)：200-205．

[28] Liao Z，St Clair JR，Larson ED，et al．Myristoylated peptides potentiate the funny current (If) in sinoatrial myocytes[J]．Channels(Austin)，2011，5(2)：115-119．

[29] Liao Z，Lockhead D，Larson ED，et al．Phosphorylation and modulation of hyperpolarization-activated HCN4 channels by protein kinase A in the mouse sinoatrial node[J]．J Gen Physiol，2010，136(3)：247-258.

[30] Tester DJ，Ackerman MJ．Cardiomyopathic and channelopathic causes of sudden unexplained death in infants and children[J]．Annu Rev Med，2009，60：69-84．

[31] Ueda K，Nakamura K，Hayashi T，et al．Functional characterization of a trafficking-defective HCN4 mutation，D553N，associated with cardiac arrhythmia[J]．J Biol Chem，2004，279(26)：27194 -27198．

[32] Laish FA，Glikson M，Brass D，et al．A novel mutation in the HCN4 gene causes symptomatic sinus bradycardia in Moroccan Jews[J]．J Cardiovasc Electrophysiol，2010，21(12)：1365-1367．

[33] Alig J，Marger L，Mesirca P，et al．Control of heart rate by cAMP sensitivity of HCN channels[J]．Proc Natl Acad Sci USA，2009，106(29)：12189.

[34] 刘如秀，暴美静，王妮娜，等．益阳活血方对损伤兔窦房结组织hcn4蛋白表达的影响[J]．实用药物与临床，2012(3)：129-132.

(本文编辑 郭怀印)

国家自然科学基金(No.81173447)；北京市中医药薪火传承3+3项目(2009年)；北京市第四批老中医药专家师承“双百”工程(2011年)；中国中医科学院“名医名家传承”(No.CM20141006)

中国中医科学院广安门医院(北京 100053)，E-mail：jinfengliu2005 @163.com

R331.1

A

10．3969/j．issn．1672-1349．2015．14．013

1672-1349(2015)14-1622-04

2015-01-21)