Beclin1基因在胃癌发生和演进中的分子作用机制

林哲洙　张　红　张　磊　罗文栋(辽宁医学院附属第三医院肿瘤外科，辽宁　锦州　121000)

Beclin1基因在胃癌发生和演进中的分子作用机制

林哲洙张红张磊罗文栋
(辽宁医学院附属第三医院肿瘤外科，辽宁锦州121000)

〔摘要〕目的探讨胃癌发生和演进中Beclin1基因的表达水平及其与临床特征的关系。方法胃癌、癌旁黏膜和转移淋巴结石蜡或新鲜标本各30例进行免疫组织化学检测。结果Beclin1蛋白在胃癌组织中的表达定位于细胞质，在胃癌组、胃癌前病变和对照组中的表达强度逐渐增强，在对照组中绝大多数为强阳性表达。三组灰度值差异显著(P＜0.05) ;组间两两比较，差异均显著(P＜0.05)。Beclin1的表达强度与淋巴结转移及胃癌分化程度密切相关(P＜0.05)，与肿瘤的部位、大小、浸润深度和TNM分期无明显相关性(P＞0.05)。结论Beclin1蛋白表达改变对胃癌的分化及转移影响较大。早期检测Beclin1蛋白的表达水平对胃癌的早期诊断及预后评估意义重大。

〔关键词〕Beclin1基因;胃癌

第一作者:林哲洙(1973-)，男，博士，主治医师，主要从事肿瘤学及普通外科学研究。

虽然化疗、放疗、基因治疗和生物治疗在胃癌治疗中广泛应用，但胃癌侵袭和转移仍是其生存率无法大幅提升的主要原因。近年来研究发现Beclin1过表达抑制裸鼠体内肿瘤形成〔1〕。Beclin1蛋白表达下调可见于肝癌和卵巢癌。目前关于Beclin1基因表达在胃癌发生、侵袭和转移中的作用及对胃癌细胞表型和生物学行为作用的机制尚无直接实验依据。本研究拟分析胃癌组织中Beclin1蛋白表达与胃癌病理生物学特征和预后的关系。

1　材料与方法

1.1材料我院2013年1月至2014年10月胃癌、癌旁黏膜和转移淋巴结石蜡或新鲜标本，均经手术及病理组织学检查证实，所有胃癌标本术前均未接受放化疗治疗。将其分为3组:①胃癌组30例，男14例，女16例，年龄32～74岁，平均(57.0± 7.1)岁。其中未侵及浆膜层者10例，侵及浆膜层者20例;局部淋巴结转移者12例，无局部淋巴结转移者18例;高、中分化腺癌11例，低、未分化腺癌19例;肿瘤临床病理分期采用2010年国际抗癌联盟/美国癌症联合委员会(UICC/AJCC)的TNM分期标准，其中Ⅰ+Ⅱ期14例，Ⅲ+Ⅳ期16例。②胃癌前病变组(中、重度不典型增生) 30例:男17例，女13例，年龄31～70岁，平均(54.5±7.2)岁;③对照组(慢性非萎缩性胃炎) 30例，男15例，女15例，年龄22～76岁，平均(52.4±7.6)岁。标本均给予10％甲醛溶液固定，石蜡包埋后连续切片，大小为3 μm。临床及病理资料均无缺失。

1.2试剂兔抗人Beclin1多克隆抗体(即用型)购自美国Proteintech Group; SP免疫组化试剂盒(PV-6001)和DAB增强性显色试剂盒(ZL19044)购自北京中杉生物试剂公司。

1.3仪器ABI PTISM 7500实时PCR和VeritiTMPCR扩增仪; BX41 Olympus显微镜; Sigma、thermo和Tomy超低温高速离心机; UVP自动成像系统、Leica组织自动包埋机、Sandon石蜡切片机和冰冻切片机;美国BD公司Facsaria 2流式细胞仪。

1.4方法将所有标本切片，给予常规脱蜡、水化，采用SP免疫组化染色、DAB显色，苏木素-尹红复染，晾干，采用中性树胶进行封片，具体操作参考说明书进行，其中阴性对照标本采用PBS替代一抗，其余操作一致。

1.5结果判断标准使用美国康塔DMR+Q550病理图像分析仪。以细胞质内出现淡黄色至棕褐色颗粒，且染色强度高于背景色者判定为阳性细胞。每个视野中的阳性表达区域取5个(400倍)，对灰度值(阳性染色的强度)进行半定量测定，选5个图像取其平均灰度值作为最终值。灰度值与阳性细胞的表达强度存在一定的关系，灰度值越高，说明其阳性表达量越低，反之则越高。

1.6统计学方法采用SPSS18.0软件进行方差分析和t检验。

2　结果

2.1Beclin1蛋白表达与胃癌临床病理特征关系的分析Beclin1的表达强度与淋巴结转移及胃癌的分化程度密切相关(P＜0.05)，与肿瘤的部位、大小、浸润深度和TNM分期无明显相关性(P＞0.05)。见表1。

表1　Beclin1蛋白表达与胃癌临床病理特征关系的分析(±s)

表1　Beclin1蛋白表达与胃癌临床病理特征关系的分析(±s)

临床病理特征　n　 Beclin1　 F值　P值肿瘤部位　　胃底、贲门　7　 138.3±10.5　 2.012＞0.05胃体　9　 137.4±11.6胃窦　14　 137.2±10.2肿瘤大小　　＞5 cm　 17　 140.2±12.9　 2.017＞0.05 ≤5 cm　 13　 139.7±11.8 TNM分期　　Ⅰ+Ⅱ级　12　 141.2±10.9　 2.341＞0.05 Ⅲ+Ⅳ级　18　 142.1±10.2浸润深度　　达浆膜层以外　10　 142.0±9.04　 2.336＞0.05未达浆膜层以外　20　 141.4±9.88淋巴结转移　　有　14　 146.8±12.4　 14.412＜0.05 无16　 137.4±12.9分化程度　　低、未分化　18　 144.7±12.4　 12.410＜0.05高、中分化　12　 136.5±11.2

2.2Beclin1蛋白在各组中的表达情况Beclin1蛋白在胃癌组织中的表达定位于细胞质，在胃癌组、胃癌前病变和对照组中的表达强度逐渐增强，在对照组中绝大多数为强阳性表达。见图1。胃癌组、胃癌前病变组、对照组灰度值(142.2±10.9、133.0±11.2、128.4±10.1)差异显著(F= 9.023，P＜0.05) ;组间两两差异均显著(P＜0.05)。

图1　各组Beclin1蛋白免疫组化结果(HE染色，×400)

3　讨论

近年来研究证明，胃癌发生和发展是多阶段、多基因和多因素参与的复杂过程。其中导致抑癌基因功能降低或缺失在肿瘤发生和演进中发挥重要作用。自噬是在营养缺乏、低氧、感染、细胞因子、激素和DNA损伤等因素作用下粗面内质网无核糖体附着区脱落的LC3分离膜包裹细胞质和待降解细胞器、蛋白质等成分形成自噬体，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物。主要包括内质网来源的大自噬、溶酶体膜来源的小自噬及分子伴侣介导自噬。第一次发现参与自噬蛋白Beclin1与酵母菌Atg6同源，其编码抑癌蛋白定位于高尔基体、内质网和线粒体，引导相关蛋白定位于自噬体膜并参与自噬体形成〔1，2〕。

人Beclin1定位于人染色体17q21上BRCA1的150 kb着丝粒区域，其28 kD编码蛋白含有BH3、卷曲螺旋结构域(CCD)和进化保守结构域(ECD)。参与形成Beclin1复合体的主要蛋白为:①Vps34:作为一种PI3KⅢ与Beclin1 ECD和CCD结构域结合形成的Vps34-Beclin1复合体可使磷脂酰肌醇磷酸化并产生三磷酸磷脂酰肌醇(PI3P)，PI3P对复合物形成具有负向调控作用。②UVRAG:可直接与Beclin1的CCD结构域结合形成复合体，调节Beclin1与Vps34复合体形成。③Ambra1:对依赖Beclin1的自噬有正面调节作用。④抗凋亡蛋白(Bcl-2、Bcl-xL和Bcl-w) :通过BH3结构域(疏水沟)与Beclin1两性α螺旋(氨基酸残基112-123)的相互作用〔3〕。死亡相关蛋白激酶(DAPK)可使Beclin1 BH3结构域T119磷酸化阻碍Beclin1与Bcl-2/Bcl-X(L)结合，促进自噬。细胞质中激活c-Jun N末端激酶JNK1磷酸化Bcl-2，导致其与Beclin1结合能力减弱，引起自噬发生〔4～6〕。此外，TRAF6可使Lys(63) (K63)连接的Beclin1泛素化，进而扰乱Beclin1复合物形成。Lys(63) (K63)连接的Beclin1泛素化〔7，8〕。Caspase-8和Caspase-3介导Beclin1断裂可以降低自噬并促进细胞凋亡。细胞应激通过死亡受体激活Caspase-8，后者断裂Beclin1 C末端对自噬具有抑制作用〔9，10〕。在转录水平上，转录因子E2F和NF-κB结合到Beclin1启动子，促进其表达上调;而miR30a的作用相反〔4〕。

Beclin1等位缺失可胚胎致死，其杂合性可提高自发肿瘤发生率，如淋巴瘤、肝癌和肺癌，正常乳腺上皮细胞和生发中心B淋巴细胞出现异常增生，Beclin1缺失细胞自噬水平减少和增殖水平升高，提示Beclin1在抑制肿瘤发生方面有重要作用〔11〕。Beclin1蛋白表达下调可见于宫颈癌、肝癌和卵巢癌〔12〕，Beclin1 mRNA表达下调也可见于胶质母细胞瘤、病期高的脑肿瘤和肺癌〔13〕。相反，Beclin1表达上调也见于皮肤鳞癌、胰腺导管腺癌〔14〕。Beclin1 mRNA表达上调见于肝内胆管细胞癌和肝细胞癌〔15〕。胃癌中Beclin1蛋白高表达〔16〕。本研究结果显示，Beclin1在胃癌组、胃癌前病变和对照组中的表达强度逐渐增强。推测其机制可能为:①肿瘤细胞在外界因子的刺激下可促进线粒体释放凋亡因子，此时细胞启动促进自噬来清除受损线粒体，导致线粒体的凋亡信号级联传导中断，细胞对低氧的耐受力得到提升，在一定程度上发挥了保护细胞的作用;②Beclin1通过Bcl-2家族可发挥拮抗凋亡的作用，存进癌细胞的高速增殖。由于Beclin1在胃癌前病变阶段即表现出明显的减弱，可见Beclin1表达下调可能参与胃癌的发生发展过程，对胃癌前病变患者行早期监测Beclin1蛋白水平，有助于提高胃癌的早期诊断率。

Dong等〔15〕研究法发现Beclin1表达与肝内胆管细胞癌淋巴结转移和不良预后呈负相关，Beclin1表达与肺鳞癌和腺癌的肿块大小呈负相关〔17〕，Beclin1表达下调与宫颈癌和卵巢癌盆腔淋巴结转移和组织分级呈现负相关。Beclin1表达与胰导管腺癌的淋巴侵袭、远处转移和不良预后呈负相关。Chen等〔18〕报道了Beclin1表达与食道鳞癌侵袭深度、淋巴结转移和临床分期负相关。Pirtoli等〔19〕发现Beclin1蛋白表达与高级胶质瘤凋亡呈正相关，而与增殖和不良预后呈负相关。本研究提示Beclin1可能参与了胃癌细胞的分化，在胃癌的发展过程中发挥作用，与胃癌的淋巴结转移关系紧密，提示Beclinl可作为评估患者预后的生物学指标并预测胃癌的发生发展。

4　参考文献

1 Fukui M，Yamabe N，Choi HJ，et al．Mechanism of ascorbate-induced cell death in human pancreatic cancer cells: role of Bcl-2，Beclin 1 and autophagy〔J〕．Planta Med，2015; 81(10) : 838-46．

2 Mizushima N，Komatsu M.Autophagy: renovation of cells and tissues〔J〕．Cell，2011; 147 (4) : 728-41.

3黄蓉，韦曦.自噬效应蛋白Beclin1的研究进展〔J〕．中外医学研究，2011; 9 (28) : 159-61.

4 Kang R，Zeh HJ，Lotze MT，et al.The Beclin 1 network regulates autophagy and apoptosis〔J〕．Cell Death Differ，2011; 18(4) : 571-80.

5 Zalckvar E，Berissi H，Mizrachy L，et al.DAP-kinase-mediated phosphorylation on the BH3 domain of beclin 1 promotes dissociation of beclin 1 from Bcl-XL and induction of autophagy〔J〕．EMBO Rep，2009; 10(3) : 285-92.

6 Zalckvar E，Berissi H，Eisenstein M，et al.Phosphorylation of Beclin 1 by DAP-kinase promotes autophagy by weakening its interactions with Bcl-2 and Bcl-XL〔J〕．Autophagy，2009; 5(5) : 720-2.

7 Inomata M，Niida S，Shibata K，et al.Regulation of Toll-like receptor signaling by NDP52-mediated selective autophagy is normally inactivated by A20〔J〕．Cell Mol Life Sci，2012; 69(6) : 963-79.

8 Shi CS，Kehrl JH.TRAF6 and A20 regulate lysine 63-linked ubiquitination of Beclin-1 to control TLR4-induced autophagy〔J〕．Sci Signal，2010;3(123) : ra42.

9 Li H，Wang P，Sun Q，et al.Following cytochrome c release，autophagy is inhibited during chemotherapy-induced apoptosis by caspase 8-mediated cleavage of Beclin 1〔J〕．Cancer Res，2011; 71 (10) : 3625-34.

10 Zhu Y，Zhao L，Liu L，et al.Beclin 1 cleavage by caspase-3 inactivates autophagy and promotes apoptosis〔J〕．Protein Cell，2010; 1(5) : 468-77.

11 Qu X，Yu J，Bhagat G，et al.Promotion of tumorigenesis by heterozygous disruption of the beclin 1 autophagy gene〔J〕．J Clin Invest，2003; 112 (12) : 1809-20.

12 Shi YH，Ding ZB，Zhou J，et al.Prognostic significance of Beclin 1-dependent apoptotic activity in hepatocellular carcinoma〔J〕．Autophagy，2009; 5: 380-2.

13 Jiang ZF，Shao LJ，Wang WM，et al.Decreased expression of Beclin-1 and LC3 in human lung cancer〔J〕．Mol Biol Rep，2011; 39(1) : 259-67．

14 Okura R，Nakamura M.Overexpression of autophagy-related beclin-1 in cutaneous squamous cell carcinoma with lymph-node metastasis〔J〕．Eur J Dermatol，2011; 21(6) : 1002-3.

15 Dong LW，Hou YJ，Tan YX，et al.Prognostic significance of Beclin 1 in intrahepatic cholangiocellular carcinoma〔J〕．Autophagy，2011; 7(10) : 1222-9.

16 Song H，Xia SL，Liao C，et al.Genes encoding Pir51，Beclin 1，RbAp48 and aldolase b are up or down-regulated in human primary hepatocellular carcinoma〔J〕．World J Gastroenterol，2004; 10: 509-13.

17 Won KY，Kim GY，Lim SJ，et al.Decreased Beclin-1 expression is correlated with the growth of the primary tumor in patients with squamous cell carcinoma and adenocarcinoma of the lung〔J〕．Hum Pathol，2012; 43 (1) : 62-8.

18Chen Y，Lu Y，Lu C，et al.Beclin-1 expression is a predictor of clinical outcome in patients with esophageal squamous cell carcinoma and correlated to hypoxia-inducible factor (HIF) -1alpha expression〔J〕．Pathol Oncol Res，2009; 15(3) : 487-93.

19Pirtoli L，Cevenini G，Tini P，et al.The prognostic role of Beclin 1 protein expression in high-grade gliomas〔J〕．Autophagy，2009; 5 (7) : 930-6.

〔2014-11-15修回〕

(编辑苑云杰)

基金项目:辽宁省科技厅项目(No．2013225305)

〔中图分类号〕R735.2

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2015) 16-4477-03;

doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.16.025