川穹嗪注射液对小鼠急性酒精性肝损伤的保护作用观察

李 甲，徐凌忠

酒精性肝病是指长期大量饮酒或含有乙醇的饮料所致的肝脏疾病，包括轻症脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝硬化、肝癌［1］。随着生活方式的改变及公共关系来往的密切，人们饮酒的机会增加。近年来我国酒精性肝损伤的发病率逐年增加，引发社会和医学界的重视。该病的发病机制较为复杂，目前尚不完全清楚，可能与乙醇及其代谢产物对肝脏的毒性作用及氧化应激等多种因素有关［2］。川穹嗪，又名四甲基吡嗪，是从伞形科藁本属植物川穹中分离提纯的生物碱单体，是中药川穹的主要有效成分，是活血行气祛淤的一种中药活性生物碱，目前广泛应用于临床，具有抗血小板聚集，改善微循环，增加脑血流和活血化淤作用［3］。近来，研究表明川芎嗪能清除氧自由基，减少其毒性，具有良好的抑制脂质过氧化作用［4］，但至今未见川穹嗪对急性酒精性肝损伤的作用报道。本文通过观察川穹嗪注射液对急性酒精性肝损伤小鼠的保护作用，初步探讨其保肝机制，为临床用药提供一定依据。

1 材料与方法

1.1 材料 动物:昆明小白鼠，雄性，18～22 g。安徽医科大学实验动物中心提供，动物合格证书号:SCXK(皖)2011－002。在温度20℃～24℃，湿度50%～60%的环境中适应性喂养1 周。普通饲料喂养，不限摄水。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂和仪器 川穹嗪注射液(北京第四制药厂)实验时用0.9%生理盐水配制;甘利欣注射液(正大天晴制药有限公司)实验时用0.9%生理盐水配制;无水乙醇(北京化工厂)。谷光甘肽(GSH)，丙二醛(MDA)检测试剂盒购买于南京建成生物工程研究所。DK-8A 电热恒温水浴箱(上海医用恒温设备厂)，ESJ110-4B 电子分析天平(沈阳龙腾电子有限公司)，Infinite M200TECAN 酶标仪(瑞士Tecan 集团公司)全自动生化分析仪(日本日立公司，型号7600-020)，离心机(安徽嘉文，型号:JW3021HR)。

1.2.2 小鼠急性酒精性肝损伤模型的建立及给药方法 雄性昆明小鼠60 只，随机分为正常组、模型组、甘利欣注射液阳性药对照组、川穹嗪注射液高、中、低量组，每组10 只。造模方法:除正常组蒸馏水灌胃外，其余各组均于每日上午用50%的酒精按50%酒精12 ml/kg 灌胃1 次，连续15 d。同时，每日下午治疗组小鼠每日分别按川穹嗪注射液高剂量(50 mg/kg)、中(100 mg/kg)、低(200 mg/kg)，正常对照组(生理盐水20 ml/kg)，模型组(生理盐水20 m l/kg)，阳性药对照组(甘利欣22.5 mg/kg)均每日腹腔注射给药，连续15 d。

1.3 指标检测

1.3.1 生化指标检测 末次给药后，禁食不禁水24 h，断头取血，快速离心后送至蚌埠三院检验科，检测血清中ALT、AST含量。

1.3.2 肝组织匀浆中的丙二醛、谷胱甘肽含量测定 剖腹摘取肝组织，生理盐水反复清洗，吸水纸吸干，取肝右叶0.2 g 左右，减碎后加入9 倍的0.9%生理盐水，根据试剂盒说明书要求制备10%的肝匀浆，检测肝匀浆中MDA、GSH 的含量。

1.3.3 肝脏组织病理形态学检查 取肝脏左叶，放入10%的甲醛中固定，经过脱水、透明、苏木素-伊红(Hematoxylin－Eosin)染色，在光镜下观察肝脏病理变化

2 结果

2.1 急性酒精性肝损伤小鼠的一般情况观察 与正常对照组比较，模型组小鼠体重减轻，皮毛无光泽，饮食减少，四肢瘫软无力，精神差，造模第3～4 d 出现稀便。除正常组外，其余各组都出现小鼠死亡，模型组最为严重，数量为3 只。川穹嗪注射液低、中剂量组各死亡1 只，小鼠饮食，醉酒，二便情况较模型组有不同程度地改善。

2.2 川穹嗪注射液对急性酒精性肝损伤小鼠肝功能指标的影响 与正常组相比，模型组小鼠血清ALT、AST 活性明显升高(P＜0.01)，表明成功制备小鼠急性肝损伤模型。甘利欣阳性药组及川穹嗪注射液三个剂量组能明显降低模型小鼠血清的ALT、AST 含量(P＜0.01)。且川穹嗪注射液作用呈剂量依赖性，见表1。

表1 川穹嗪注射液对酒精性肝损伤小鼠肝功能指标的影响(n=10，±s)

表1 川穹嗪注射液对酒精性肝损伤小鼠肝功能指标的影响(n=10，±s)

注:与正常组比较，#P＜0.05;与模型组比较* P＜0.05。

组别ALT(U/L)AST(U/L)正常组33.3 ±12.3645.3 ±9.88模型组175.2 ±25.78#226.9 ±28.62#甘利欣注射液组48.1 ±9.49*47.4 ±8.71*川穹嗪注射液组:高剂量组87.3 ±17.8*90.7 ±7.93*中剂量组100.3 ±19.93*126.9 ±14.72*低剂量组128.3 ±19.44*187.7 ±22.41*

2.3 川穹嗪注射液对急性酒精性肝损伤小鼠肝组织中GSH和MDA 含量的影响 与正常对照组对比，模型组小鼠肝组织中MDA 水平显著上升(P＜0.01)，GSH 含量明显下降(P＜0.01)。与模型组比较，甘利欣注射液阳性对照组和川穹嗪注射液的3 个剂量组的MDA 含量明显减低(P＜0.01)，甘利欣注射液阳性对照组以及川穹嗪注射液的3 个剂量组肝匀浆GSH 含量明显增加(P＜0.01)。表明川穹嗪注射液对急性酒精肝损伤小鼠的保护作用与其提高体内抗氧化活性有关。见表2。

表2 川穹嗪注射液对急性酒精性肝损伤小鼠肝组织中MDA 和GSH 含量的影响(n=10，±s)

表2 川穹嗪注射液对急性酒精性肝损伤小鼠肝组织中MDA 和GSH 含量的影响(n=10，±s)

注:与正常组比较#P ＜0．05;与模型组比较* P ＜0．05。

组别MDA(nmol/mgprot)GSH(mg/gprot)正常组5．49 ±1．466．21 ±2．13模型组15．72 ±3．75#2．37 ±0．51#甘利欣注射液组6．51 ±2．38*6．06 ±2．25*川穹嗪注射液组:高剂量组6．82 ±2．29*5．28 ±0．99*中剂量组9．95 ±3．07*4．41 ±1．38*低剂量组11．63 ±5．41*3．84 ±1．41*

图1 HE 染色检测各组小鼠肝组织病理形态学的变化(×400)

2.4 川穹嗪注射液对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏病理组织学变化的影响 正常组肝细胞排列整齐，以中央静脉为中心向四周放射状排列，细胞细胞核圆形或椭圆形，无碎裂、居中，胞质丰满，包膜完整。模型对照组小鼠肝组织损伤严重，肝小叶结构遭到破坏，肝细胞排列紊乱，大量肝细胞胀明显，中央静脉周围肝细胞可见点状或灶样坏死，细胞核被挤向一边，胞浆出现大小不一的脂肪空泡，呈气球样变，并伴有炎性细胞浸润。阳性对照药组和川穹嗪射液3 个剂量组的肝细胞肿胀程度、脂质沉积及脂肪变性、炎性浸润程度得以不同程度缓解。其中川穹嗪注射液高剂量组效果最好，包膜完整，结构清晰。川穹嗪注射液具有改善肝细胞病理损伤的功效。见图1。

3 讨论

酒精的致病因素单一，但目前其发病机制尚未能明确，近来发现氧化应激与酒精性肝损伤的发生、发展关系密切。酒精作为一种强烈的氧化应激原和高渗透性的小分子有机物，在代谢过程中可诱生出大量的自由基，是造成多器官、多系统损伤的重要机制之一［5］。在体内积累过多的自由基和活性氧自由基簇(ROS)会对细胞产生高度毒性。

正常情况下，ALT 和AST 只存在于细胞内，当肝细胞受损坏死后，ALT、AST 释放入血，导致血清中ALT、AST 升高，因此转氨酶是肝细胞损伤的最敏感指标［6］。MDA 是氧自由基攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸形成脂质过氧化物的一种，其水平高低可以间接地反映出机体细胞受自由基攻击的程度。GSH 是生物体内重要的抗氧化酶，其含量大小反映了机体清除氧自由基的能力［7］。川穹是我国传统中药，据文献报道［8］，该药可显著降低老龄大鼠脑、心、肝中过氧化脂质含量.并能提高脑、肝中单胺氧化酶和超氧化物歧化酶活力。为探讨川穹嗪注射液的保肝及其、机制，本实验选用了血清中ALT、AST，肝组织中MDA 和GSH 以及肺组织病理切片这几个有代表性的实验指标，通过实验，我们发现川穹嗪注射液能够降低酒精小鼠ALT、AST 的含量，能够明显降低酒精导致的GSH耗竭，抑制肝脏MDA 的生成。通过病理观察，经川穹嗪注射液的治疗，小鼠肝组织的水肿、脂肪病变、坏死等损伤有不同程度地改善，发挥一定的保肝作用。

总之，川川穹嗪注射液能够降低转氨酶，提高肝组织GSH 活性，减少MDA 的产生。一定程度清除自由基、抑制氧化应激，从而对急性酒精性肝损伤有一定的保护作用。

［1］朱慧艳，李婷冶，陈 洁.酒精性肝病的诊断和治疗进展［J］.医学综述，2014，20(14):2556-2559.

［2］王毕娟，王 沁，张志强，等.酒精性肝病患者淋巴细胞染色体损伤与氧化应激关系［J］.世界华人杂志，2010，18(4):388-391.

［3］饶丽华，赵诗云，尹小明.川芎嗪抗血小板聚集的实验研究［J］.检验医学，2014，29(9):976-977.

［4］钱 超.川芎嗪对心血管的药理作用［J］.内蒙古中医院，2014，23(10):107-108.

［5］何 宁，张静姝，张 静，等.乙醇诱导小鼠急性肝细胞损伤模型中NF-κB 的表达［J］.癌变·畸变·突变，2014，26(1):52-55.

［6］俸家福，涂植光.肝功能相关的血清酶学研究进展［J］.医学综述，2007，13(3):225-230.

［7］韩 玲，陈克冀.川芎嗪对缺血再灌注心肌保护作用的研究进展［J］.解放军药学学报，2002，18(1):41-43.

［8］粟 坤，郭忠兴，郭朝阳.川芎嗪对老龄大鼠脑、心、肝脏过氧化脂质含量的影响［J］.佳木斯医学院学报，1997，1(1):11-12.