腹腔注射四氯化碳建立大鼠肝纤维化模型

魏晓光， 郭 辉， 陈永珍， 张于娟

(1. 苏州大学 a. 基础医学与生物科学学院；b. 苏州大学 医学部实验中心，江苏 苏州 215123；2. 江南大学 无锡医学院，江苏 无锡 214064)



腹腔注射四氯化碳建立大鼠肝纤维化模型

魏晓光1a， 郭 辉2， 陈永珍1a， 张于娟1b

(1. 苏州大学 a. 基础医学与生物科学学院；b. 苏州大学 医学部实验中心，江苏 苏州 215123；2. 江南大学 无锡医学院，江苏 无锡 214064)

腹腔注射四氯化碳(Carbon Tetrachloride, CCl4)构建大鼠肝纤维化模型，追踪观察模型大鼠病理组织学改变，为临床研究提供可靠的实验模型。模型组雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠按1.0 ml/kg剂量腹腔注射40% CCl4-橄榄油混悬液，每周3次，共计8周；对照组同时腹腔注射等量的生理盐水。于给药1～4、6、8周末每组随机取6只大鼠肝脏，肉眼观察肝脏组织大体改变，经HE和Masson染色观察肝脏病理学改变。肝脏组织光镜下显示：模型组给药第2周肝细胞发生脂肪变性；第4周肝组织局部形成假小叶，门管区有大量纤维细胞聚集；第6～8周肝组织出现大面积假小叶，建模成功率高达88.3%。采用多点、密集的腹腔注射方法可更有效地建立大鼠肝纤维化模型, 为临床提供可靠的研究模型。

四氯化碳； 肝纤维化； 大鼠； 模型

0 引 言

肝纤维化是肝脏对各种慢性肝损伤的代偿反应，是由于持续性肝损伤造成肝细胞持续坏死，导致细胞外基质、细胞群和细胞因子复杂改变，导致过多胶原在肝内沉积所致，常伴有炎症并可发展为肝硬化[1-2]。根据肝纤维化病因建立动物模型来研究其发病机制，能为其预防和治疗提供一定的实验基础[3]。CCl4构造肝纤维化动物模型是经典的研究方法，并最早、最广泛地应用于实验性肝纤维化研究。因实验方法和条件差异缺乏统一标准，如CCl4剂量和给药方式的不同，往往造成模型建立所需时间较长和成功率偏低[4-6]。本实验拟采用新剂量和多点、较密集的腹腔注射CCl4方式建立大鼠肝纤维化动物模型，运用HE和Masson染色来追踪肝纤维化发病进程，寻求一种快速、可靠、高效的肝纤维化动物模型建立方法。

1 动物模型建立

(1) 实验动物。Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠90只，质量200～300 g，由苏州大学动物科学研究中心提供。

(2) 动物分组及造模。选用SD雄性大鼠90只，随机选择30只作为对照组，余下为模型组。模型组按1.0 ml/kg 腹腔注射40% CCl4-橄榄油混悬液，每周3次，共计8周，对照组同时腹腔注射等量的生理盐水。模型组于给药1周末随机取6只大鼠，对照组5只大鼠。称量两组大鼠体重，25%乌拉坦麻醉后取出肝脏于10%甲醛中固定，进行组织病理学检查。模型组和对照组在2、3、4、6、8周末采取同第1周末的处理方法。

2 实验结果

2.1 实验大鼠一般状态

对照组大鼠毛色有光泽，饮食饮水正常，体质量逐渐增加，生长发育状态良好且无死亡。模型组大鼠每次给药后情绪萎靡，烦躁不安。随给药时间的延长饮水减少，食欲下降，活动减少，皮毛蓬乱无光，体质重减轻。给药3周后开始出现死亡。

2.2 肝纤维化模型成功率

83只大鼠建模成功，成功率88.3%。对照组和模型组大鼠前2周均成活。模型组第3周死亡1例，建模成功率90%；第4周1例，成功率90%；第6周2例，成功率80%；第8周3例，成功率70%；模型组大鼠的成活率是88.3%(见表1)。模型组大鼠死亡率随给药时间延长呈上升趋势，实验中死亡大鼠肛门处有大量污秽，腹部肿胀、变硬，剖腹可见腹腔严重腹水，肝脏肿胀，表面包裹白色薄膜，似慢性中毒死亡。

2.3 病理学改变

2.3.1 大体改变

对照组：大鼠肝脏呈红褐色，有光泽，质地较软，边缘锐利，表面光滑细腻(图1(a))。模型组：给药第1周大鼠肝脏大体正常(图1(b))；第2周大鼠肝脏充血呈暗红色，表面尚光滑且有少量脂肪覆盖(图1(c))；第3周大鼠肝脏呈淡黄色并与膈肌粘连，质地较硬，边缘圆钝(图1(d))；第4周肝脏颜色发黄，表面凹陷(图1(e))；第6周大鼠腹腔内有少量腹水，肝脏颜色变为灰白色且与周围组织严重黏连，表面皱缩并出现坚硬小结节(图1(f))；第8周时腹腔内出现较严重肝腹水，肝脏表面出现大量小结节或颗粒，质地硬，切面可见肝脏正常结构被岛屿状结节代替，结节周围有灰白色结缔组织间隔包绕(图1(g))。

表1 实验过程中两组大鼠死亡情况

图1 对照组和模型组大鼠肝脏病理学大体改变

(a)对照组，(b)模型组第1周，(c)模型组第2周，(d)模型组第3周，(e)模型组第4周，(f)模型组第6周，(g)模型组第8周

2.3.2 HE染色

肝组织HE染色光镜显示： 对照组肝脏肝小叶结构正常，界限清晰；中央静脉旁有放射状排列的肝细胞索，肝细胞体积较大，胞浆丰富；汇管区结构清晰(图2(a))。模型组随造模时间延长，肝纤维化程度逐渐加重，第1～2周肝小叶结构可辨，肝窦扩张淤血，中央静脉周围部分肝细胞出现轻度脂肪变，部分汇管区结缔组织增生(图2(b)、(c))。第3周肝索排列紊乱，肝窦狭窄，大部分肝细胞肿大，脂肪变细胞中出现大小不等球形脂滴(图2(d))。第4周时，中央静脉淤血明显，肝组织病变区域多，面积大，正常肝小叶结构破坏，肝细胞索排列紊乱，中央静脉周围及汇管区胶原纤维与网状纤维沉积形成纤维间隔，肝小叶结构紊乱(图2(e))。第6～8周时，肝组织内假小叶广泛形成并出现肝细胞不同程度的变性、坏死(图2(f)、(g))。

图2 对照组和模型组肝脏组织HE染色

(a)正常(400×)，(b)模型组第1周(400×)，(c)模型组第2周(400×)，(d)模型组第3周(100×)，(e)模型组第4周(100×)，(f)模型组第6周(40×)，(g)模型组第8周(40×)

2.3.3 Masson染色

肝组织Masson染色光镜显示：正常组肝小叶结构完整，肝细胞索排列整齐；注射CCl4第1周，近中央静脉周围肝细胞呈少量脂肪变性(图3(a),(b))。第2周开始出现肝细胞脂肪变性，并有少量胶原纤维生成(图3(c))。第3周出现大面积的肝细胞脂肪变性，胶原纤维数量增多(图3(d))。第4周出现明显胶原纤维沉积(图3(e))。第6周出现胶原纤维沉积和形成明显的假小叶(图3(f))。第8肝脏胶原纤维逐渐增加连接成小叶间隔，形成大量的假小叶(图3(g))。

3 讨 论

目前，国内外利用CCl4建立肝纤维化模型的造模途径有皮下注射、腹腔注射、灌胃和蒸气吸入等方法[7-9]。皮下注射造模周期长，动物死亡率高，更重要的是操作不当会发生皮下渗漏；灌胃法造模时间长，且个体差异较大，大多数大鼠实验结束前已死亡；蒸气吸入法较复杂且容易引起肝外病变。经过比较，我们认为利用CCl4腹腔注射制备肝纤维化模型具有皮下注射、灌胃、蒸气吸入造模所不可比拟的优点：快速高效、操作简便、病理结果可靠，不易外漏。

通过查阅文献[10-12]，预实验遴选40% CCl4-橄榄油悬浮液以首次剂量5.0 ml/kg的剂量注射，结果大部分大鼠急性 CCl4中毒而死亡。CCl4进入体内15 min即可引起肝细胞损伤，至48 h 达到高峰，随后进入修复阶段。因此可采用间隔3～4 d 注药1次，即在一次染毒造成肝损害后的修复期再次给药，重复“损害—修复—损害”的过程诱导肝纤维化。本方法采用多点，较密集的1.0 ml/kg剂量注射，每周3次，共计8周。实验选择雄性大鼠的原因是不同性别的肝脏组织雌激素受体表达不同。研究显示，女性肝脏雌激素受体含量是男性的3倍，这可能是造成肝纤维化性别差异的原因所在[13]。所得大鼠肝纤维化模型组织病理特点与肝纤维化病理改变相似，通过观察CCl4诱发大鼠肝纤维化不同时段肝脏大体形态和病理组织学结果可明显看出各模型组的区别。随给药时间延长肝纤维化程度增加，成功建立肝纤维化模型，符合实验设计的预期结果。该模型既可有效形成肝纤维化且橄榄油过多沉积造成脂肪堆积，与临床病人肝纤维化多伴有高脂饮食相接近，建模成功率高达88.3%。

图3 对照组和模型组肝脏组织Masson三色染色(40×)

(a)正常，(b)模型组第1周，(c)模型组第2周，(d)模型组第3周，(e)模型组第4周，(f)模型组第6周，(g)模型组第8周

4 结 语

如何建立一种理想的肝纤维化动物模型，一直是实验研究的重点和难点。一个理想的肝纤维化动物模型应该符合以下条件：①与人类肝纤维化疾病的基本病变特征相似；②病变有一定发展过程，以及病程存在可逆与不可逆的阶段性演进过程；③形成率高，死亡率低，重复性好；④造模方法简便易行和动物易获得，经济实用[14-16]。本实验采用小剂量，多次重复在一次染毒造成肝损害后的修复期再次给药的方法，缩短造模周期，降低大鼠死亡率，快速成功地建立CCl4诱导肝纤维化模型，是一个较为理想的肝纤维化动物模型。

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Studies on Rats Hepatic Fibrosis Model Established by Intraperitoneal Injection of Carbon Tetrachloride

WEIXiao-guang1a,GUOHui2,CHENYong-zhen1a,ZHANGYu-Juan1b

(1a. School of Biology and Basic Medical Sciences; 1b. Experimental Center of Medical College, Soochow University, Suzhou 215123, China; 2. Wuxi Medical School, Jiangnan University, Wuxi 214064, China)

To establish rat liver fibrosis model, CCl4solution was injected intraperitoneally and the pathological changes were observed. The result can offer fibrosis model for clinical studies. The authors use SD male rats as model group, and they were injected 40% CCl4-olive oil solution, and the control group was injected saline, intraperitoneally three times a week for 8 weeks. At the end of the 1st, 2nd, 3rd, 4th, 6th, and 8th weeks, 6 rats from each group were randomly selected to demonstrate HE and Masson staining and observe the liver pathological changes. Hepatic steatosis was observed under the microscopy after CCl4-olive oil administration for 2 weeks in model group. After 4 weeks, some pseudolobules formed and numerous fibroblasts assembled at the portal area. At six to eight weeks, numerous liver pseudolobules appeared. The rate of success modeling is up to 88.3%. Hence, multi-point and intensive intraperitoneal injection method can be more effective to rat liver fibrosis model, which is reliable for clinical research.

carbon tetrachloride (CCl4); liver fibrosis; rats; model

2015-01-30

魏晓光(1988-)，男，河南周口人，硕士生，主要研究方向为肝纤维化。Tel.: 18896500285; E-mail: wxg163361@163.com

张于娟(1979-),女，江苏丹阳人，博士，主要方向肝细胞及胎源性疾病。

Tel.: 13771922996；E-mail: zhangyujuan@suda.edu.cn

R-331

A

1006-7167(2015)11-0034-04