双色双融合及双色分离探针检测成人急性淋巴细胞白血病BCR－ABL 融合基因及11q23/MLL 基因重排

梁 亮，王 巍，李庆华，文瑞婷，蔡静怡，张宇明，杨志刚 (广东医学院附属医院血液科，广东 湛江 524001)

间期荧光原位杂交技术(iFISH)的双色双融合探针和双色分离探针因其简便、精确性、稳定性高等特点，近年来被广泛应用于识别恶性血液病的变异基因及异常核型［1－2］。BCR－ABL 融合基因和混合谱系白血病基因(MLL)与白血病分型、治疗及预后密切相关，已成为急性淋巴细胞白血病(ALL)诊断的常规检测项目。2010 ～2013 年间笔者应用双色双融合BCR－ABL 探针、双色分离11q23/MLL 探针对105 例初诊成人ALL 患者进行了检测，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料:观察组:选择2010 年1 月～2013 年9 月我院收治的初诊成人ALL 患者105 例，其中男68 例，女37 例，年龄最小14 岁，最大85 岁。对照组:同期10 例确诊为缺铁性贫血患者，其中男3 例，女7 例，年龄16 ～78 岁，中位年龄38.7岁，骨髓细胞形态学检查为增生性贫血骨髓象。

1.2 试剂与探针:试剂:0.075 mol/LKCl，3∶1 甲醇/冰醋酸固定液，2×SSC 溶液，70%、85%、100%乙醇，0.3%NP－40/0.4×SSC，0.1NP－40/2×SSC，4，6－二脒基－2 苯基吲哚(DAPI)Ⅱ，杂交缓冲液。FISH 探针:BCR－ABL 探针选用双色双融合探针，MLL 探针选用双色分离探针(均为英国Cyctocell 公司产品)。其中BCR 探针长约112 Mb，为光谱绿色标记，ABL探针长约650 kb，为光谱橘红色标记。MLL 探针长约255 kb，22q11.2 为光谱橘红色标记，9q34 为光谱绿色标记。

1.3 iFISH 检测步骤:取治疗前骨髓标本1.0 ～2.0 ml 加秋水仙素制备染色体标本，参考探针试剂说明书进行制片、探针准备、加入探针、变性、杂交、洗涤、复染等步骤，最后将杂交玻片置于型荧光显微镜下，选用DAPI/FITC/Rhodamine 滤光片组下观察检测。MLL 基因重排正常信号显示2 个融合的黄色信号，典型异常信号为1 红1 绿1 黄或2 红2 绿;BCR－ABL 融合基因正常信号显示2 红2 绿，典型异常信号为1 红1 绿2 黄的融合信号。每例至少分析200 个细胞，用FISH 软件采集图像。

1.4 iFISH 阈值界定:每份样本分析200 个细胞，计算出显示异常信号的细胞数、百分比的平均值及标准差，阈值定义为平均值+3 倍标准差，即阈值=平均值+3×标准差。本研究将阳性细胞率＞5.0%定义为MLL 基因重排和BCR－ABL 融合基因阳性。

1.5 染色体核型分析:骨髓细胞染色体制备采用短期培养法，采用R 显带技术，按国际细胞遗传学命名标准(ISCN2009)进行核型分析，每例核型分析数至少20 个分裂相。

2 结果

2.1 临床特征:所有患者都进行了FISH 检测BCR－ABL 融合基因及MLL 基因重排，其中BCR/ABL 融合基因阳性患者20 例，占19.0%(20/105)，男性女性患者各10 例，平均年龄43.2 岁。白细胞总数＞100×109/L 6 例(30%)，30 ～100×109/L 8 例(40%)，＜10×109/L 2 例(10%)，外周血白细胞中位数为105.4×109/L。经FAB 及免疫分型确诊B－ALL 16 例，B/My－ALL 4 例。MLL基因重排阳性患者5 例，占4.8%(5/105)，均为男性，平均年龄28.2 岁，外周血白细胞中位数为180.2×109/L。经FAB 及免疫分型确诊B－ALL 4 例，B/My－ALL 1 例。

2.2 iFISH 检测结果:BCR－ABL 融合基因阳性荧光信号为50%～98%，MLL 基因重排阳性荧光信号为64 ～95%(iFISH检测结果，见图1 ～4)。

图1 阳性图像

图2 阴性图像

图3 阳性图像

图4 阴性图像

2.3 染色体核型分析结果:BCR－ABL 融合基因阳性和MLL基因重排阳性患者中有23 例进行染色体核型分析，结果如下:无分裂相6 例(26.1%)，正常核型7 例(30.4%)，单纯t(9;22)核型2 例，Ph+伴附加染色体异常3 例;11q23/MLL 基因重排染色体核型3 例;其他异常核型2 例。

2.4 疗效:25 例患者中有16 例接受了诱导缓解化疗，9 例放弃治疗。BCR－ABL 融合基因阳性患者首次诱导化疗完全缓解率为50%(6/12)，2 例诱导缓解未达CR 的患者予伊马替尼单药治疗，1 例在1 个月后死亡，1 例3 个月后获完全缓解，缓解6 个月后复发死亡，生存期为12 个月;仅有2 例患者联合伊马替尼治疗取得血液学及分子遗传学完全缓解，其中1 例行Auto－PBSCT 后继续予伊马替尼维持治疗，生存期分别为6个月、16 个月。4 例MLL 基因重排阳性患者首次诱导化疗后均获得完全缓解，但3 例在缓解后2 ～12 个月复发死亡。

3 讨论

目前常用于检测白血病融合基因的方法主要有常规染色体核型分析、RT－PCR 技术及荧光原位杂交技术等。iFISH技术可检测特异性的染色体异常，且不受分裂相限制，可分析大量间期细胞(通常观察200 ～400 个细胞)，其灵敏度较高、精确性较好，可弥补传统染色体显带技术的不足。本研究23 例BCR－ABL 融合基因及MLL 重排基因阳性患者核型结果中仅检测出Ph 染色体5 例，11q23 基因重排染色体3 例，检出率仅有34.8%(8/23)。而无分裂相6 例，核型正常、未检测到异常7 例，其他异常核型2 例，该部分病例应用iFISH 技术检测BCR－ABL 融合基因阳性13 例(BCR－ABL 阳性信号50%～98%)，MLL 重排基因阳性2 例(MLL 基因重排阳性信号56%～95%)。由此可见，iFISH 技术的失败率较低，稳定性较高，应用iFISH 技术能确定常规染色体显带技术未能发现的隐匿性核型，提高Ph 染色体及11q23 基因重排染色体的检出率。

进一步追踪分析疾病缓解状态发现，1 例患者首疗程化疗达骨髓完全缓解时iFISH 复查MLL 基因重排阳性细胞比例为12%，2 个月后即出现复发，MLL 基因重排阳性细胞比例再次增高为80%，而首疗程取得血液学及分子遗传学缓解患者，其持续缓解期为12 个月。治疗后同时复查骨髓细胞形态学检查及BCR/ABL 融合基因患者有4 例，其中2 例经伊马替尼联合化疗后达血液学及分子遗传学完全缓解，而仅达到血液学完全缓解1 例患者(FISH 检测BCR/ABL 融合基因阳性信号仍有57%)选择伊马替尼单药治疗，经伊马替尼单药治疗3 个月后复查骨髓虽然达到完全缓解，iFISH 检测BCR－ABL 融合基因阳性信号5%，9 个月后iFISH 检测BCR/ABL 融合基因阳性信号96%，骨髓提示复发。从上述动态iFISH 检测数据可以看到，iFISH 技术不仅较常规染色体显带技术更为灵敏，还可对治疗过程中白血病阳性克隆细胞进行定量分析，较好地评估白血病微小残留病灶及缓解质量，有助于确定临床治疗方案。

综上所述，应用双色双融合及双色分离iFISH 探针可以有效地检测出BCR－ABL 融合基因和MLL 基因重排，对ALL危险度分层、个体化治疗及预后评估具有重要的临床指导意义。

［1］ Primo D，T abernero MD，Ras illo A，et al.Patterns of BCR/ABL gene rearrangements by interphase fluorescence in situ hybridization( FISH) in BCR/ABL + leukemias:incidence and underlying Genetic abnormalities［J］.Leukemia，2003，17(6):1124.

［2］ 郭 搏，达万明，韩晓萍等.双色双融合荧光原位杂交检测成人急性淋巴细胞白血病BCR－AB L 基因重排［J］.中华检验医学杂志，2006，29(10) :902.