股骨头坏死患者坏死骨组织中miRNA表达谱变化

杨玉宝，刘洪亚，阚金庆，高忠礼，李林(山东医学高等专科学校附属医院，山东临沂76000;临沂市人民医院;吉林大学中日联谊医院;延边大学附属医院)

股骨头坏死患者坏死骨组织中miRNA表达谱变化

杨玉宝1，刘洪亚1，阚金庆2，高忠礼3，李林4
(1山东医学高等专科学校附属医院，山东临沂276000;
2临沂市人民医院;
3吉林大学中日联谊医院;4延边大学附属医院)

摘要:目的观察股骨头坏死患者坏死骨组织中miRNA表达谱变化，探讨miRNA在股骨头坏死发生发展中的作用。方法选择正常股骨粗隆间骨折(对照组)、股骨头坏死(观察组)患者各4例，分别取正常及坏死股骨头骨组织，采用基因芯片技术检测miRNA表达谱变化;经聚类分析寻找明显上调和下调的基因，以RT-PCR法检测其表达量。结果两组采用miRNA芯片检测426个miRNA，上调比例≥2的有2条(hsa-miR-494-st和hsa-miR-29a-st)，下调比例≤0.5的有1条(hsa-miR-486-5p-st)。观察组hsa-miR-29a-st的相对表达量为3.56±5.02，对照组为1.16 ±0.15，两组比较，P＜0.05;观察组hsa-miR-494-st、hsa-miR-486-5p-st的相对表达量分别为2.32±1.42、1.85± 1.24，对照组分别为4.13±3.18、3.78±2.69，两组比较，P均＞0.05。结论股骨头坏死患者坏死骨组织中存在miRNA表达谱变化，其中hsa-miR-29a-st可能在股骨头坏死发生、发展过程中起调控作用。

关键词:缺血坏死性股骨头;microRNA;聚合酶链反应;基因芯片

股骨头坏死是一种难治性疾病，其发病机制目前尚不清楚。股骨头坏死一般自死骨边缘和周围活组织结合部开始修复，表现为血管再生、新骨形成和死骨吸收;随着修复向死骨中央推进，死骨吸收增强，而血管再生和新骨形成明显减弱。研究证实，miRNA在基因调控血管生成过程中发挥重要作用。目前，关于miRNA在股骨头坏死发生、发展过程中的作用少见报道。2011年11月～2013年6月，我们采用基因芯片检测股骨头坏死患者的坏死骨组织中miRNA表达谱，并对有显著变化的miRNA进行RT-PCR定量分析。现报告如下。

1　资料与方法

1.1临床资料选择临沂市人民医院收治的正常粗隆间骨折患者4例(对照组)、股骨头坏死需人工股骨头或全髋人工关节置换患者4例(观察组)，男7例、女1例，年龄55～76岁。排除糖尿病、免疫系统慢性疾病。术中留取负重区软骨下骨组织2～5 g装入冻存管，置液氮中，1 h内转入超低温冰箱冻存备用。

1.2miRNA检测方法取两组骨组织标本，加入Trizol试剂提取总RNA。将1 μg总RNA加入1.5mL EP管，加入500 μL 1mmol/L Tris-Cl缓冲液，再加入1 μL ATP充分混匀;离心后收集管底溶液，放置于冰上。取0.2mL EP管，加入1 μg总RNA。如样品体积超过8 μL，使用真空浓缩仪浓缩至8 μL以下，置于冰上。再根据制备poly(A)加尾及生物素标记miRNA和miRNA基因芯片杂交，通过聚类分析从基因芯片结果中寻找与对照组相比上调比例≥2和下调比例≤0.5的miRNA。对明显变化的miRNA进行RT-PCR验证，以2－ΔΔCt计算其表达量。1.3统计学方法采用SPSS17.0统计软件。所得数据以珋x±s表示，组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

两组采用miRNA芯片检测426个miRNA，上调比例≥2的有2条(hsa-miR-494-st和hsa-miR-29ast)，下调比例≤0.5有1条(hsa-miR-486-5p-st)。两组差异miRNA相对表达量比较见表1。

表1　两组差异miRNA相对表达量比较()

表1　两组差异miRNA相对表达量比较()

注:与对照组比较，*P＜0.05。

组别　hsa-miR-494-st　hsa-miR-29a-st hsa-miR-486-5p-st观察组　2.32±1.42　3.56±5.02*1.85±1.24对照组4.13±3.18　1.16±0.15　3.78±2.69

3　讨论

miRNA是一类长18～25 nt的内源性非编码小RNA，由一段具有发夹样结构、长70～80 nt的单链RNA前体剪切后形成［1］。miRNA广泛存在于真核

生物中，具有高度保守性、时序性和组织特异性，对细胞组织的功能及生命活动起重要调控作用。由于其高度的时空特异性及类似于RNA干扰的特殊机制，使其在肿瘤的发病机制中广受关注。miRNA的表达受到血流量的调控［2］。研究显示，特异性miRNA可能与股骨头坏死有关。Wang等［3］对坏死股骨头患者血清miRNA进行深度测序，发现股骨头坏死患者血清中存在异常表达的miRNA。王义生等［4］用靶向特异性基因小干扰RNA(siRNA)预防酒精性股骨头坏死，发现利用siRNA腺病毒载体能够阻断MSCs和PPAR-γ基因表达，阻止其成脂分化，保持其成骨分化，促进骨修复，能在一定程度上预防酒精性股骨头坏死。目前己知的作用于成骨细胞生成和分化相关通路的miRNA有miRNA-208［5］、miRNA-141和miRNA-200a［6］，它们通过调控BMP-2通路发挥作用，具有很强的促成骨分化能力;此外，miRNA-210可通过抑制AcvR1b抑制TGF-β/activin信号通路，促进成骨细胞的分化［7］。Suzuki等［8］观察了miRNA-210在股骨头坏死患者血浆中的表达，认为miRNA-210在股骨头坏死过程可能起调控作用。

本研究对正常股骨头和坏死股骨头骨组织进行miRNA芯片检测，共检测426个miRNA;经聚类分析发现，上调比例≥2的有2条(hsa-miR-494-st和hsa-miR-29a-st)，下调比例≤0.5有1条(hsa-miR-486-5p-st)。RT-PCR检测显示，hsa-miR-494-st、hsamiR-486-5p-st的相对表达量与对照组比较差异无统计学意义，hsa-miR-29a-st的相对表达量较对照组显著升高。hsa-miR-29a-st是一种在非编码区小的调节基因，主要功能表现在转录与翻译的水平上［9］。hsa-miR-29a-st是miRNA-29家族中的一个亚型［10～13］，其主要包括miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-29c，对人类肿瘤的发病起重要的调控作用。人类血液供应丰富的骨肉瘤中miRNA-29a、miRNA-29b较正常骨组织有显著变化，主要表现为下调基因;其与直肠癌的发病率也有明显的相关性。新近研究证实，miRNA通过靶基因E2Fs来参与调节细胞反应性缺氧缺血的各种生理病理过程［14］。因此推测，在正常股骨头骨组织向股骨头坏死组织转化的过程中，上调基因hsa-miR-494-st、hsa-miR-29a-st及下调基因hsa-miR-486-5p-st可能通过某些靶基因的调控作用来完成，尤其是hsa-miR-29a-st在正常与缺血坏死性骨组织中存在明显差异，其可能是加速股骨头坏死的重要调控基因。

综上所述，正常股骨头骨组织与股骨头缺血坏死性骨组织之间存在miRNA基因的变化，存在明显上调与下调基因，这些miRNA可能引起调控血管靶基因受体的改变，使股骨头骨组织血流受到影响，进一步加速股骨头坏死。在股骨头骨组织发生坏死的整个过程中，miRNA可能发挥着至关重要的作用。

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收稿日期:( 2015-05-08)

通信作者:李林

基金项目:吉林省教育厅十一五科学技术研究项目(2010-280)。

文章编号:1002-266X(2015)34-0074-02

文献标志码:A

中图分类号:R681.8

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.34.033