参附注射液对胆汁环境中成纤维细胞的影响



参附注射液对胆汁环境中成纤维细胞的影响

杨楷，刘莉，周耿，张海军

(遵义医学院附属医院 肝胆外科，贵州 遵义563099)

[摘要]目的 探讨在胆汁环境中参附注射液对成纤维细胞的影响，以判断在此环境中成纤维细胞的增殖是否能被参附注射液抑制，从而减轻胆道瘢痕性狭窄。方法 通过建立体外胆汁环境中成纤维细胞生长模型，运用参附注射液干预。设计分为空白组、胆汁组、实验组，实验组又分为5个浓度梯度亚组。运用MTT法测定各组中成纤维细胞OD值，用SPSS20.0统计软件处理,分析参附注射液是否能抑制成纤维细胞的形成。结果 成纤维细胞OD值随参附注射液含量及干预时间的增加逐渐减小(P<0.05)，差异具有统计学意义。说明在胆汁环境中成纤维细胞的增殖能被参附注射液抑制。结论 参附注射液对胆汁环境中成纤维细胞的增殖有抑制作用。

[关键词]参附注射液；成纤维细胞；胆汁环境

参附注射液来源于参附汤，是从附片、人参等中药中提取而成[1]，属于活血化瘀类中药。许多研究发现活血化淤类中药具有促进创伤组织修复、抑制瘢痕增生的作用[2]。并且有研究提出，具有活血化淤作用的丹参注射液，可以在早期促进胆道损伤后愈合，后期在一定程度上减少胆道瘢痕的过度增生[3]。其主要机理是改善微循环、降低局部的缺血缺氧状态，以达到促进其愈合的作用。参附同样具有活血化瘀的作用，那么作用于受损伤的胆

管，是否也能起到相同的作用呢？由此我们设计制作成纤维细胞在体外胆汁环境中生长的模型，并用参附注射液干预。分析判断参附注射液是否能抑制体外胆汁环境中成纤维细胞的增值，从而推测出它对抑制胆道瘢痕的形成是否具有一定作用。

1材料

人瘢痕成纤维细胞株(上海汉博生物试剂公司)；T管引流术后人正常胆汁(遵义医学院附属医院肝胆外科提供)；参附注射液(雅安三九药业说明：每毫升参附注射液含红参0.1 g，附片0.2 g，其有效药物成分0.3g)；胎牛血清(四季青生物制品公司)；DMEM培养基(HyClone-PIERCE 公司)；MTT(SIGMA公司)；二甲基亚砜DMSO(SIGMA公司)；OLYPMUS BX51显微镜 (日本OLYPMUS公司)；SW-LG-1F超净工作台(苏州安泰公司)；HPX-9082 MBE型CO2培育箱(上海博讯医疗)。

2方法

2.1实验分组体外培养成纤维细胞株3～6代。按设计分组，分为胆汁组(仅含等量的胆汁培养基)；实验组参附注射液浓度梯度，分为10 mg/mL组、20 mg/mL组、40 mg/mL组、80 mg/mL组、160 mg/mL组；空白组(仅含等量培养液)。

2.2成纤维细胞在胆汁环境中生长的模型制备[4]取经T管引流的人正常胆汁，过滤、除菌，稀释50倍后[4]，混合等量细胞培养基，配置成实验用胆汁培养基。各组浓度的参附注射液分别取2 mL，混合等量实验用胆汁培养基后加入培养瓶内，作为体外培养。pH为7.4的PBS溶解MTT(0.1mol/L)，配制成浓度为5g/L的溶液[5]。生长良好的成纤维细胞，按设计实验各组接种到96孔板上，每孔5×103个，重复3次。5%CO2孵箱中，设定温度37 ℃，饱和湿度下，将各组成纤维细胞培养24 h。加入配制好的MTT溶液；观察对象分别为空白组、胆汁组、实验组的各亚组。

2.3标本采集不同浓度的参附药液干预各组中生长的成纤维细胞，时间设定12、24、48 h，MTT法测定各组成纤维细胞的OD值。

3结果

组别12h24h48hFP空白组4.27±0.254.53±0.324.17±0.320.5620.59胆汁组17.10±0.1016.93±0.0618.63±0.061251.500.0010mg/mL组15.83±0.0615.00±0.1014.90±0.10166.500.0020mg/mL组14.87±0.1514.50±0.1013.33±0.20123.440.0040mg/mL组13.63±0.2312.87±0.1511.67±0.5933.410.0080mg/mL组10.63±0.158.87±0.208.73±0.25136.500.00160mg/mL组7.77±0.126.77±0.065.87±0.3296.780.00F2416.512319.96822.96P0.000.000.00

3.1.1空白组中OD值随时间增加无明显变化,组间比较无统计学意义(F=0.562,P>0.05)。

3.1.2同一时间点，胆汁组OD值明显小于空白组OD值，具有统计学意义(P<0.05)；实验组OD值随参附注射液浓度的增加而减小，具有统计学意义(P均<0.05)。

3.1.3同一浓度中，随参附注射液干预时间的延长成纤维细胞的OD值下降，具有统计学意义(P均<0.05)。

3.2光镜观察

3.2.1成纤维细胞数量在空白组中较少，细胞核较小，排列较稀松(见图1A)。

3.2.2成纤维细胞在胆汁组中数量较多，细胞核较大，核仁较清晰，排列较紧密(见图1B)。

3.2.3按照各实验组与空白组平均吸光值的比值求出细胞存活率，依据浓度-存活率求出其存活率为50%的药物浓度，既50%IC的药物浓度为60 mg/mL。以此浓度的参附注射液对体外培养的成纤维细胞分别干预12、24、48 h，通过光镜观察到成纤维细胞胞核明显，细胞突起部分回缩，表明其活性下降，增殖可能都受到了抑制[2](见图2A、B、C)。

A:空白组48 h；B:胆汁组48 h。图1　成纤维细胞形态(×400)

A:60 mg/mL参附注射液干预12 h;B:60 mg/mL参附注射液干预24 h;C:60 mg/mL参附注射液干预48 h。图2　参附注射液干预后各时段的成纤维细胞形态(×400)

4讨论

胆管是胆汁排入肠道的唯一通路，它与人类的健康息息相关。胆道损伤一旦发生，如果早期处理不当就会出现胆管瘢痕性挛缩，造成胆道狭窄，治疗起来非常困难的，给患者带来极大痛苦。

胆道手术及胃肠道手术有时会造成胆管的意外损伤，也就是医源性胆管损伤。其中90%由胆囊切除术造成，5%来源于胆管手术，3%来源于胃大部切除手术。特别是腹腔镜技术近年来得到长足的发展，广泛运用于胆囊、胃、十二指肠、肝脏切除术中，胆管损伤也随之增多，并且有逐年上升的趋势。

胆管损伤如在术中发现，通常处理起来会比较容易，预后相对较好。如术后才发现，渗漏的胆汁刺激周围组织，发生炎性改变，结缔组织增生，绝大多数会造成胆管狭窄。伴随胆管瘢痕狭窄，胆汁引流不畅、淤积，出现黄疸和反复发作胆道感染，甚至有可能造成胆汁淤积性肝硬化、门静脉高压症等，使肝脏功能出现难以逆转的损害。手术修复后往往还会再次出现胆道瘢痕性狭窄，形成一个恶性循环。

胆管损伤后纤维化是造成狭窄的主要原因[6]，瘢痕性挛缩和良性狭窄是其最明显的表现。在胆管损伤瘢痕愈合这一过程中，胆汁刺激黏膜成纤维细胞，使其逐渐转化成肌成纤维细胞，并伴随胶原纤维过度合成[7]，导致瘫痕挛缩，引起胆道狭窄。胆道瘢痕化愈合表现为成纤维细胞的过度增生，而整个过程是在胆汁的浸泡中完成的。胆汁会致纤维化和阻碍损伤组织愈合[8]；胆汁与胶原纤维接触，会增加炎症反应[9]，这些因素均会引起或加重胆管狭窄，这已在犬胆道损伤模型的实验研究中得到证实[10]。

通过改善微循环，可以促进瘢痕的愈合。研究证实参附具有提高细胞抗应激及耐受缺氧、减少细胞缺血再灌注损伤、保护细胞功能的作用。还有使局部微循环得以改善，促进肉芽组织生长，加快伤口愈合的作用。并且有特异性提高细胞免疫功能的作用[11-13]。

在本实验中我们发现，胆汁组中测得成纤维细胞OD值与空白组测得OD值比较，在同一时间点明显增大，说明胆汁能促进成纤维细胞增殖。实验组与胆汁组比较，随着参附注射液浓度的增加，在同一时间段成纤维细胞OD值有减小的趋势。说明在本实验范围内，随参附注射液浓度的增加能逐步减少胆汁环境中成纤维细胞的增殖。在同一浓度组中，随参附注射液干预时间的延长，胆汁环境中成纤维细胞的OD值有减小的趋势。说明在本实验范围内，随参附注射液干预时间延长，能逐渐减少胆汁环境中成纤维细胞的增殖。通过形态学观察，也可发现胆汁对成纤维细胞的增长有促进作用。而运用参附注射液干预后，成纤维细胞的增殖受到了抑制。

在本实验中，我们设计并成功制作的模型能够说明胆汁环境对成纤维细胞增值有一定促进作用。通过分析证实，参附注射液对胆汁环境中成纤维细胞的增殖有一定的抑制作用。并且在本实验范围内，发现对胆汁环境中成纤维细胞抑制的程度与参附注射液的浓度及干预的时间存在正相关关系。

综上所述，胆汁环境不利于胆道损伤的自我修复，可能会使瘢痕过度增生。而早期应用一定剂量的参附注射液可以在一定程度上减轻胆道瘢痕的过度增生，从而有可能减少胆道狭窄的发生率或狭窄程度。但由于胆道损伤后瘢痕形成致使胆管逐渐狭窄的过程十分复杂，同时受到很多因素的影响，因此，还需进行长期深入的探索，才有可能发现更为有效的治疗方法。

[参考文献]

[1] Du T，Sun R J,Xu G L，et al.Study on determining pharmacokinetics parameters of Shenfu injection by pharmacology effect method[J].Chinese Journal of Clinical Pharmacology and Therapeutics，2012， 17(1): 69-72.

[2] 董春桃.丹参的药理作用与临床应用进展[J].山西医药杂志,2007,36(1):54-55.

[3] 王得胜,刘莉，李建国，等.丹参对胆道损伤修复过程中α-SMA表达的影响及其意义[J].第三军医大学学报,2011,33(15):1657-1659.

[4] 熊伟,张小文,吴涛,等.胆汁对体外培养人成纤维细胞作用的实验研究[J].中华肝胆外科杂志,2009，5(5):379-381.

[5] Feng Y F，Jing Z X，Wang Y H，et al.MTT Method for Testing the Effect of Shuanghuanglian Powder on IC50 of Mast Cells in Rats’ Peritoneal[J].Information on Traditional Chinese Medicine,2014，31(2):60-62.

[6] Tao L，Li Q，Ren H Z，et al.The prevention of bile duct scar formation after bile duct injury repair by using sustained-release basic fibroblast growth factor[J]. Journal of Nanjing University(Natural Sciences),2012，48(6):797-803.

[7] Huang Z F，An H M， Pu Q F，et al.Experimental study on topical application of 5 - fluorouracil to prevent the bile duct cicatricial stenosis by electrocoagulation injury[J].Journal of Hepatopancreatobiliary Surgery，2012，25(3):222-224.

[8] Li J J ，Li T，Meng Y P，et al.Significance of expression of TGF-1 and MMP1 in bile duct injury caused by electrocautery in rabbits[J].World Chinese Journal of Digestology， 2013,21 (29):3097-3101.

[9] Sun J P, Liu L, Zhao D P,et al.Effect of Salvia yunnanensis C.H.Wright on biological behavior of scar-derived fibroblasts[J].Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Enjineering Research,2009,13(2):320-323.

[10] 肇毅,潘立群.丹参促进创伤修复机制的研究现状[J].南京中医药大学报,2000，16(4):253-254.

[11] 杨树龙,冯志强,邬丽莎,等.参附注射液对家兔急性肾缺血再灌注损伤的预防作用及机理研究[J].中国病理生理杂志,2003,19(3):353.

[12] 朱玲,周黎明,王正容.参附注射液的作用及作用机制的研究进展[J].四川生理科学杂志,2004,26(2):77.

[13] 李驰,肖锋.参附注射液在肠麻痹方面的临床与实验研究概况[J].中国民间疗法，2006,14(1):62.

[收稿2015-04-29;修回2015-05-24]

(编辑：王福军)

临床医学研究

Study of Shenfu injection on fibroblasts in bile environment

YangKai,LiuLi,ZhouGeng，ZhangHaijun

(Department of Hepatobiliary Surgery, The Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099,China)

[Abstract]Objective To analyze the effect of Shenfu injection on fibroblasts in bile environment in order to judge whether fibroblast proliferation could be inhibited by Shenfu injection to reduce biliary stricture. Methods Fibroblasts growth model was established in bile environment,which was intervened by Shenfu injection. We divided the groups into the blank control group, bile group and experimental groups that was divided into 5 subgroups according to the concentrations .We calculate OD value of the fibroblasts by the MTT method to analyze whether Shenfu injection could inhibit the formation of fibroblasts. We used SPSS20.0 software for statistical analysis.Results The OD values decreased gradually with Shenfu injection concentration and intervention time (P<0.05).Conclusion In bile environment, the fibroblasts could be inhibited by Shenfu injection.

[Key words]Shenfu injection；fibroblast；bile environment

[文献标志码][中图法分类号] R657.4 A

[文章编号]1000-2715(2015)03-0271-04

[基金项目]贵州省卫生厅科学技术基金项目(NO:黔卫发[2009]122)。

[通信作者]刘莉，女，主任医师，硕士生导师，研究方向：胆道损伤，E-mail:li88li@yeah.net。