HPLC-DAD双波长法同时测定脑络欣通胶囊中阿魏酸及天麻素含量

程　刚，胡容峰，3，4，王　斌，丁领振，方文悠

(1.安徽中医药大学研究生部，安徽 合肥　230038；2.新安医学教育部重点实验室，安徽 合肥　230038；

3.安徽省“115”新安医药研究与开发创新团队，安徽 合肥　230038；

4.安徽省中药研究与开发重点实验室，安徽 合肥　230038)



HPLC-DAD双波长法同时测定脑络欣通胶囊中阿魏酸及天麻素含量

程刚1，2，胡容峰1，2，3，4，王斌2，丁领振1，方文悠1，2

(1.安徽中医药大学研究生部，安徽 合肥230038；2.新安医学教育部重点实验室，安徽 合肥230038；

3.安徽省“115”新安医药研究与开发创新团队，安徽 合肥230038；

4.安徽省中药研究与开发重点实验室，安徽 合肥230038)

[摘要]目的建立双波长同时测定脑络欣通胶囊中天麻素和阿魏酸含量的方法，为脑络欣通的质量控制提供依据。方法采用高效液相色谱-二极管阵列检测器和Welch Materials C8色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流动相：乙腈-0.01%磷酸；梯度洗脱(乙腈：0～10 min，6%；10～30 min，6%→35%)；流速：1.0 mL/min；柱温：35 ℃；检测波长：320 nm(阿魏酸)和222 nm(天麻素)。结果在30 min内，实现了阿魏酸与天麻素双波长同时测定，二者含量分别在0.20～2.39 μg(r=0.999 9)和0.20～2.41 μg(r=0.999 8)范围内与峰面积呈现良好的线性关系，平均加样回收率分别为99.5%和99.1%(n=6)。结论双波长检测对复方中阿魏酸与天麻素定量更准确，二者同时测定能有效提高分析效率，该方法可用于脑络欣通胶囊的质量控制。

[关键词]高效液相色谱-二极管阵列器；双波长；脑络欣通；阿魏酸；天麻素

川芎和天麻作为常用药对[1]，存在于许多中药复方如大芎丸(《圣济总录》卷十五)、天麻丸和九味羌活丸(《中华人民共和国药典·一部》)，两者同时作为天舒胶囊(《中华人民共和国药典·一部》)脑络欣通胶囊等中药制剂有效成分，临床上具有广泛的应用基础。阿魏酸和天麻素分别为中药川芎和天麻中的活性成分，已有的含量测定方法[2-6]存在流动相体系酸度较高，色谱峰保留时间长，单一检测波长下天麻素的色谱峰响应值较低等问题。因此，有必要建立较为有效的含量分析方法。脑络欣通是新安医学名家王乐匋治疗缺血性脑血管疾病的临床验方，由天麻、当归和川芎等药物组成，全方具有活血通络、熄风养血的功效[7-8]，为新安医学益气活血代表方剂。本实验在课题组前期研究[9]的基础上，选择高效液相色谱-二极管阵列检测器(high performance liquid chromatography-diode array detector，HPLC-DAD)双波长同时检测，建立阿魏酸和天麻素含量测定方法，为进一步完善脑络欣通质量控制方法提供实验依据。

1材料与仪器

1.1试药天麻素(批号110807-200205，纯度95.4%)、阿魏酸(批号110773-201012，纯度99.6%)：均由中国食品药品检定研究院提供；三七、黄芪、川芎、当归、天麻、红花、蜈蚣等药材：均购自安徽合肥乐家老铺中药饮片厂，经安徽中医药大学药学院生药系俞年军教授鉴定符合2010版《中华人民共和国药典》相关项目的要求；脑络欣通胶囊(每粒0.38 g，批号分别为140701、140801、140802)及阴性样品均自制；乙腈(瑞典Oceanpak)为色谱纯；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

1.2主要仪器硅胶G薄层板：山东省青岛市基亿达硅胶试剂厂；Agilent 1100型HPLC仪：美国安捷伦科技有限责任公司；Satorius BP211D型十万分之一电子天平：德国赛多利斯有限公司；HS10260D型超声波清洗器：天津奥特赛恩斯仪器有限公司。

2方法

2.1对照品贮备液的制备将阿魏酸和天麻素置于五氧化二磷减压干燥器中干燥12 h，精密称定阿魏酸对照品3.98 mg和天麻素对照品4.02 mg，分别置于10 mL棕色容量瓶中，加甲醇定容至刻度，4 ℃冰箱中保存备用。

2.2混合对照品溶液的制备精密移取1 mL天麻素和阿魏酸对照品贮备液，置于10 mL棕色容量瓶中，甲醇稀释溶解，定容至刻度，摇匀，制成含阿魏酸39.8 μg/mL和天麻素40.2 μg/mL的混合对照品溶液。

2.3供试品溶液的制备取胶囊内容物约0.5 g，精密称定，置10 mL容量瓶中，精密加入体积分数70%甲醇10 mL，称定质量，超声(功率500 W，频率40 kHz)处理20 min，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀。将上清液滤纸过滤。取续滤液，过0.45 μm微孔滤膜，即得供试品溶液。

2.4阴性对照品溶液的制备按处方配比，称取除川芎、当归以外和除天麻以外的其他药材，按制备工艺制成胶囊，再取胶囊内容物按“2.3”项下方法制得阴性对照品溶液。

2.5色谱条件Welch Materials C8色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈-0.01%磷酸溶液，梯度洗脱程序(0～10 min，乙腈6%；10～30 min，乙腈6%→35%)，流速1.0 mL/min，柱温35 ℃，DAD检测器，检测波长分别为320 nm(阿魏酸)和222 nm(天麻素)。

2.6系统适用性实验按“2.5”项下色谱条件，分别吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液5 μL，进样分析，结果表明，脑络欣通中阿魏酸与天麻素有效成分均能与其他组分达到基线分离，且阴性样品溶液无扰。色谱图见图1和图2。

2.7线性关系的考察分别精密吸取混合对照品溶液5、10、20、30、40、60 μL注入高效液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积y为纵坐标，浓度x为横坐标进行线性回归，得阿魏酸和天麻素的回归方程及相关系数。阿魏酸的回归方程为y=2 957.8x+1.485 4(r=0.999 9)，线性范围为0.20～2.39 μg；天麻素的回归方程为y=2 019.4x-45.446(r=0.999 8),线性范围为0.201～2.41 μg。

2.8精密度实验精密吸取混合对照品溶液5 μL，注入液相色谱仪，连续测定6次，计算阿魏酸与天麻素峰面积的RSD分别为0.14%、0.22%。结果表明，仪器精密度良好，符合定量分析要求。

2.9稳定性实验精密吸取供试品溶液5 μL，分别在制备后0、2、4、8、12、24 h进样，计算阿魏酸与天麻素峰面积的RSD分别为0.48%、0.46%。结果表明，供试品溶液在24 h内稳定。

2.10重复性实验称取同一批号样品(批号140701)6份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.5”项下色谱条件进样分析，测得阿魏酸与天麻素的峰面积，并计算阿魏酸与天麻素含量。结果显示，阿魏酸和天麻素含量的RSD分别为1.26%、1.75%，表明该方法重复性良好。

2.11加样回收率试验精密称取已知含量的样品(批号140701)6份，每份约0.1 g，分别加入混合对照品贮备溶液(含阿魏酸0.37 mg/mL，天麻素0.56 mg/mL)1.0 mL，按“2.3”项下方法制备供试液，分别吸取5 μL进样，记录峰面积。根据加入量和测得量，计算加样回收率。见表1。

表1　加样回收率结果(n=6)

2.12含量测定取批号分别为140701、140801、140802的胶囊样品，精密称定，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.5”项下色谱条件进行测定，测得每粒胶囊中阿魏酸的含量分别为1.42、1.43、1.41 mg,平均含量为1.42 mg ，RSD分别为1.30%、1.06%和0.28%；每粒胶囊中天麻素的含量分别为2.12、2.14、2.11 mg，平均含量为2.12 mg，RSD分别为2.09%、2.87%和0.39%。

3讨论

已有报道[2，4，6]同时测定阿魏酸和天麻素的方法，但是流动相体系酸度过大，单一波长(270 nm)下检测天麻素的响应值较低，色谱峰保留时间相对较长。本实验在前期调研的基础上，优化色谱条件，采用梯度洗脱和双波长同时测定阿魏酸及天麻素，方法可行，提高了检测的效率和灵敏度。

据文献报道[10-11]，阿魏酸性质不稳定，见光极易分解，因此，在研究中对照品和供试品制备过程中应严格避光操作及保存。

分别配制两种成分的标准品溶液于紫外波长200～400 nm范围扫描，结果表明，阿魏酸在320 nm处有最大吸收，天麻素在222 nm处有最大吸收和270 nm有较弱的吸收，为了提高含量测定的灵敏度，故选择相应最大吸收波长作为检测波长，使两成分具有更高的响应值，减少实验误差，定量更准确。

分别考察甲醇-1%醋酸水溶液、甲醇-0.01%磷酸水溶液以及乙腈-0.01%磷酸溶液，发现乙腈-0.01%磷酸水溶液色谱峰更尖锐，峰形较对称。其中流动相体系中0.01%磷酸水溶液(pH值6～7)条件下能更好地保护色谱柱。同时分别考察了Welch Materials C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Welch Materials C8色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)对阿魏酸和天麻素分离效果的影响。结果显示，Welch Materials C8色谱柱对二者的分离效果更好。

本研究结果表明，双波长检测对复方中阿魏酸与天麻素定量更准确，二者同时测定能有效提高分析效率。该方法合理可靠，可用于脑络欣通胶囊的质量控制。

参考文献:

[1]陈学鸿.药对“天麻-川芎”辨证治疗偏头痛[J].中国临床医生,2002,30(12):54-55.

[2]黄敏,冉懋雄,徐文芬,等.HPLC测定川天康胶囊中阿魏酸和天麻素的含量[J].中成药,2000,22(8):543-546.

[3]国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社,2010:38,54,124.

[4]魏元峰,张宁,冯怡.HPLC-DAD法同时测定大川芎复方释药系统中阿魏酸与天麻素的含量[J].中国中医药信息杂志,2009,16(7):46-48.

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[6]赵辉,武晓红,蒲晓辉.HPLC法同时测定天舒胶囊中阿魏酸和天麻素[J].中成药,2014,36(1):111-114.

[7]王键,刘昕.脑络欣通对局灶性脑缺血再灌注大鼠热休克蛋白及碱性成纤维细胞生长因子表达的影响[J].中西医结合学报,2004,2(4):271-273．

[8]王键,陈业农,唐巍,等.脑络欣通对局灶脑缺血/再灌注大鼠神经干细胞及相关调节因子影响的实验研究[J].中国中医基础医学杂志,2008,14(11):837-839．

[9]丁领振,胡容峰,王键,等.脑络欣通胶囊的质量控制研究[J].中成药，2014,36(2):296-300.

[10]胡益勇,徐晓玉.阿魏酸的化学和药理研究进展[J].中成药,2006,28(2):253-255.

[11]宋浩亮,罗华菲,官洪义.阿魏酸及其制剂的稳定性研究[J].安徽医药,2003,7(4):252-253.

Simultaneous Determination of Ferulic Acid and Gastrodin in Naoluoxintong Capsule by Dual-wavelength High-performance Liquid Chromatography-Diode Array Detector

CHENGGang1,2,HURong-feng1,2,3,4,WANGBin2,DINGLing-zhen1,FANGWen-you1,2

(1.GraduateDivisionofAnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230038,China; 2.KeyLaboratoryofXin’anMedicine,MinistryofEducation,AnhuiHefei230038,China; 3.Anhui“115”Xin’anTraditionalChineseMedicineResearch&DevelopmentInnovationTeam,AnhuiHefei230038,China; 4.AnhuiProvinceKeyLaboratoryofR&DofChineseMedicine,AnhuiHefei230038,China)

[Abstract]ObjectiveTo establish a dual-wavelength method for simultaneous determination of the content of gastrodin and ferulic acid in Naoluoxintong Capsule, and to provide a basis for the quality control of Naoluoxintong Capsule. MethodsHigh-performance liquid chromatography-diode array detector and Welch Material C8column (250 mm × 4.6 mm, 5 μm) were applied. The conditions for detection were a mobile phase of acetonitrile and 0.01% phosphoric acid, gradient elution (acetonitrile: 0-10 min, 6%; 10-30 min, 6%-35%), a flow rate of 1.0 mL/min, a column temperature of 35 ℃, and a detection wavelength of 320 nm (ferulic acid) or 222 nm (gastrodin). ResultsThe dual-wavelength simultaneous determination of the content of ferulic acid and gastrodin was realized within 30 min. The content of ferulic acid and gastrodin was in a good linear relationship with peak area within 0.20-2.39 μg (r=0.999 9) and 0.20-2.41 μg (r=0.999 8), respectively. The average recovery rates of ferulic acid and gastrodin were 99.5% and 99.1%, respectively (n=6). ConclusionThe dual-wavelength determination of the content of ferulic acid and gastrodin in the compound is more accurate. Simultaneous determination of the two ingredients can increase analysis efficiency effectively, and can be applied as the method of quality control for Naoluoxintong Capsule.

[Key words]high-performance liquid chromatography-diode array detector; dual wavelength; Naoluoxintong; ferulic acid; gastrodin

收稿日期：(2015-06-10；编辑：张倩)

通信作者：胡容峰，hurongfeng@163.com

作者简介：程刚(1991-)，男，硕士研究生

基金项目：国家科技支撑计划(2012BAI26B03)；国家自然科学基金资助项目(81274100)；安徽省学术和技术带头人及后备人选科研活动经费资助项目(皖人社秘2011-38号-26)

[中图分类号]R927.2[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2015.06.026