1株马源致病性蜡样芽孢杆菌的分离与鉴定

王玉田 ， 王承民 ， 刘艳华 ， 何宏轩 ， 金银姬 ， 刘 鑫 ， 白 煦 ， 李志衍 ，郑瑞峰

(1.北京市畜牧总站 ， 北京朝阳100107 ； 2中国科学院动物研究所 ， 北京朝阳100101 ；3.北京农道众联农业科技有限公司 ， 北京海淀100086 ； 4.中国马业协会 ， 北京朝阳100125)

1株马源致病性蜡样芽孢杆菌的分离与鉴定

王玉田1， 王承民2， 刘艳华3， 何宏轩2， 金银姬1， 刘 鑫1， 白 煦4， 李志衍1，郑瑞峰1

(1.北京市畜牧总站 ， 北京朝阳100107 ； 2中国科学院动物研究所 ， 北京朝阳100101 ；3.北京农道众联农业科技有限公司 ， 北京海淀100086 ； 4.中国马业协会 ， 北京朝阳100125)

蜡样芽孢杆菌(bacilluscereus)是革兰阳性需氧产芽孢杆菌，一种广泛分布于土壤、水、空气、饲料、食品和环境中产芽孢杆菌。该菌为条件致病菌，容易污染食物和饲料，也可引起牛乳房炎、子宫内膜炎，但还未见马感染该菌的报道。

2015年5月，北京市某马术俱乐部赛马皮肤下有直径2～3 cm大小的脓肿结节。结节逐渐增大，突起于皮肤表面，变成脓肿，然后破溃流出黄白色或淡红色脓液，逐渐形成溃疡。溃疡高于皮肤表面如蘑菇状或周围突起中间凹陷，易于出血，不易愈合。溃疡不断地分泌出脓性分泌物，使病灶附近的毛粘结成痂皮,检测内容和结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 病料来源 (1)脓汁：对没有破溃脓包皮肤用碘酊和75%医用消毒酒精消毒，用无菌注射器吸取或用消毒棉签蘸取脓汁，放入营养肉汤培养基中；(2)血液：前腔静脉无菌采集静脉血5mL，注入血液增菌培养基中。

1.2 细菌分离培养、生化鉴定 营养肉汤和血液培养基37℃厌氧和需氧培养48h增菌；将脓汁样本涂抹于新鲜血液和巧克力琼脂培养基培养；用革兰染色镜检，观察细菌形态，多次分离纯化，得到纯化细菌[1]。接种各种糖发酵培养基进行糖发酵试验，吲哚试验、甲基红试验、V-P 试验、触酶试验、硫化氢试验，淀粉水解试验、D-阿拉伯糖试验、青霉素抑制试验、观察生化反应特性[2]。

1.3 细菌16S rDNA 的检测 取分离到细菌的DNA作为模板，用细菌菌种鉴定通用引物(7F:5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’, 1540R:5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’；27F:5’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3’,1492R:5’-GGTTA-CCTTGTTACGACTT-3’)进行PCR 扩增。扩增产物送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。测序结果提交GenBank，并与其他芽孢杆菌进行比对，确定16S 基因型。

2 结果与分析

2.1 细菌培养特征 经鲜血琼脂培养基和巧克力琼脂培养基生长良好。菌落浅灰色，毛玻璃状，伴有草绿色溶血和透明溶血环。在鲜血琼脂培养基上呈明显β型溶血(见中插彩版图1A)。菌体两端钝圆，单个或长链状排列，无荚膜，有鞭毛，能运动。芽孢呈椭圆形，位于中央或近端。革兰染色呈阳性，可形成芽孢(见中插彩版图1B)。

2.2 细菌16S rDNA 分析 芽孢杆菌群成员有13 个基因型，根据16 S rDNA 序列差异性分析，确定该菌株16 S rDNA 序列(GenBank 登录号为JX294967)为蜡样芽孢杆菌群(见图2)。

2.3 生化特性、药敏试验 该菌株能发酵葡萄糖、蔗糖和麦芽糖，不发酵乳糖、木糖、甘露醇和果胶糖。过氧化氢酶试验、甲基红试验(M.R.)和乙酰甲基甲醇试验(V-P)为阳性，吲哚试验和硫化氢试验为阴性。青霉素抑菌试验阴性，在高浓度处生长，排除炭疽杆菌[3]。对青霉素、氨苄西林、头孢菌素耐药；对克林霉素、红霉素、磺胺类药物敏感。分离菌生化特性符合蜡样芽孢杆菌

3 讨论

3.1 通过病原检测，可以判定为蜡样芽孢杆菌感染，引起皮肤产生脓疱，破溃导致出现的淋巴脉管炎。病马由皮肤伤口感染，经淋巴及血液循环引起全身菌血症。通过文献检索，该菌是人医骨科创伤感染的常见菌，导致创面均有红肿、渗出和脓性分泌物。与本病例症状相符，但是在国内在马上没有报道，需引起临床兽医注意。

3.2 马传染性脉管炎是由伪皮疽组织胞浆菌引发的疾病，是真菌感染性疾病。通过涂片镜检及培养结果为阴性。应用大剂量抗生素克林霉素治疗，伤口处涂抹磺胺粉，经15 d治疗后治愈。

[1] GB4789.14—2014, 食品微生物学检验 蜡样芽胞杆菌检验[S].

[2] 尚红,王毓三,申子瑜.全国临床检验操作规程[M].北京:人民卫生出版社,2015:667-668.

[3] NY/T 561—2015,动物炭疽诊断技术[S].

2016-08-04

王玉田(1971-)，男，高级兽医师，本科，从事动物疫病诊治工作，E-mail:646795388@qq.com

郑瑞峰，E-mail：1138028814@qq.com

S852.6

B 文章标号：0529-6005(2016)11-0052-02