组织工程尿道重建从基础到临床应用的反思

郭海林 综述， 撒应龙 审校

(上海交通大学附属第六人民医院泌尿外科,上海　200233)



·综述·

组织工程尿道重建从基础到临床应用的反思

郭海林 综述， 撒应龙 审校

(上海交通大学附属第六人民医院泌尿外科,上海200233)

摘要：外伤、经尿道手术及尿道下裂等因素导致的尿道狭窄的治疗一直是困扰泌尿外科的难题，特别是复杂性和长段尿道狭窄的治疗更是棘手。组织工程技术在尿道狭窄修复重建治疗中显示了良好的应用前景，其主要内容包括种子细胞、支架材料及两者的有机结合。本文将从基础和临床两个层面对组织工程在尿道狭窄修复重建中的应用做一综述，并寻求出其存在的问题及发展方向。

关键词：尿道狭窄；组织工程；种子细胞；支架材料；尿道重建

尿道损伤、炎症、肿瘤、手术及先天性畸形等因素导致的尿道狭窄严重影响患者的生活质量[1-2]，其治疗一直是泌尿外科最棘手的难题之一。既往以多种自体组织如口腔黏膜、阴茎阴囊皮瓣、会阴皮肤或肠自体移植物为重建材料的替代疗法在尿道狭窄修复重建治疗中显示了良好的应用前景[3-7]，但是移植物替代以后所带来的并发症如移植物挛缩、狭窄、结石形成、毛发生长、憩室产生、腹腔脏器干扰等问题却一直无法得到解决。这种“以牺牲正常组织为代价，以手术创伤修复组织缺损”的治疗模式在临床应用中受到严峻挑战[8]。组织工程技术的兴起和迅猛发展为尿道病变的修复开辟了新的治疗途径，并已逐渐成为目前最有前景的生理性修复技术。

组织工程学技术是根据细胞生物学、生物材料及生物工程学的基本原理，探寻用于改善或修复病损组织器官结构、功能的生物活性替代物的一门科学[9]，主要内容包括种子细胞、支架材料及两者的有机组合。本文将从基础和临床两个层面对组织工程中的种子细胞、生物支架材料及两者的有机结合在尿道狭窄修复重建中的应用进展及所遇到的问题做一综述。

1种子细胞

组织工程尿道中常用的种子细胞大多取自自身组织，并在体外扩增培养后复合于支架材料上，与支架材料一起植入尿道缺损部位修复尿道缺损。根据细胞分化类型可分为已分化细胞和干细胞两种。

1.1已分化的上皮组织种子细胞这些可作为上皮组织种子细胞的已分化成熟体细胞存在于特定的组织器官内，免去了诱导分化的难题，可以作为种子细胞比较直接地用于尿道狭窄修复重建中，但其亦具有有限的自我更新潜能，且只可分化为一种特定的细胞类型等问题，且这类细胞只有在组织更新、老化和受到损伤时才可重新进行细胞分化并形成特定组织[10]。

1.1.1自身尿路上皮细胞通过活检获得尿路上皮细胞(如包皮细胞、尿道上皮细胞、膀胱移行上皮细胞等)是组织工程尿道中获取种子细胞的传统方法，但该方法亦存较多缺陷，如取材不便，操作或手术对泌尿道产生损伤较大等。针对上述问题，UDO NAGELE[11]和FOSSUM[12]分别探索了从尿液中和膀胱灌洗液中分离培养获得自身尿路上皮细胞的具有较少侵入性操作的方法。但其方法亦存在取得细胞较困难、培养较繁琐等缺点。近年来，包皮细胞由于来源丰富，取材相对容易，体外易于培养扩增，有利于其在临床的运用[13]。FU等[14]将培养的包皮细胞与膀胱黏膜下脱细胞基质复合以后用于兔尿道缺损的构建，术后显示尿道管腔通畅，未见明显狭窄，组织学亦显示分界的细胞层次，表明包皮细胞作为构建组织工程化尿道种子细胞的可行性，但对于做过包皮环切手术及阴茎手术的人此种方法亦存在组织材料的有限性等问题。

1.1.2自身口腔黏膜上皮细胞口腔黏膜细胞(包括颊黏膜和舌黏膜)因具有韧性大、抗感染力强，取材方便，创伤小等特点，而被作为种子细胞广泛地用于组织工程尿道重建中[15]。且和表皮细胞相比,其与尿道黏膜细胞同属黏膜组织来源,可最大程度模拟尿道黏膜的特点。我们既往实验研究证实口腔黏膜上皮在尿液环境中有向尿路上皮转化的潜能[16]，且我们将体外培养获得的口腔黏膜细胞接种于BAMG上后发现其与BAMG显示了良好的生物相容性，其很快在BAMG上黏附、生长，并伸出伪足，连接成片形成复层结构，为我们进一步将此复合材料用于构建组织工程尿道奠定了坚实基础[17]。且LI[17]及BHARGAVA[15]均证实将口腔黏膜细胞作为尿道狭窄修复重建的种子细胞用于尿道狭窄修复重建中可取得较为理想的效果，是组织工程尿道重建较为理想的种子细胞。

1.2干细胞成熟体细胞取材不便，对取材部位造成创伤较大，且体外培养易老化，难以达到组织工程尿道重建中所需的种子细胞数量。干细胞在组织工程中的引入，为上述问题的解决提供了可能。干细胞是一类未分化细胞，具有自我更新、高效增殖及分化的潜能，可分化为成熟的不可再生细胞及可再生细胞[18]。当尿路上皮细胞有病变如干燥闭塞性龟头炎(lichen sclerosis, LS)而不适宜用于或口腔黏膜细胞不足以提供组织工程化尿道所需的种子细胞时，干细胞可作为组织工程化尿道的种子细胞用于尿道狭窄的修复重建。虽然胚胎干细胞可作为尿道上皮细胞的来源，但其中涉及到的传统伦理观念、恶性增殖潜能及有效调控等问题限制了其进一步的研究应用。而成人干细胞如骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)、脂肪干细胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)及尿源性干细胞等由于可避免上述问题，使其近年来得到了广泛关注[19,20]。虽然BMSCs能够在体内适合环境下向平滑肌细胞和尿路上皮细胞分化，但其获取方式创伤性较大，细胞产量低，体外培养扩增时间长等问题限制了它的应用。ADSCs具有自我更新及定向分化潜能，可分化为多种细胞系，分化可调节、可重复进行，且材源丰富，取材创伤小，为组织工程尿道重建研究的种子细胞选择提供了一种新的思路及可能。2009年，LIU等[21]将ADSCs与上皮细胞共培养，发现两种细胞的直接接触能诱导ADSCs向尿路上皮细胞方向分化。证明了在离体模拟上皮系细胞生长微环境条件下，脂肪干细胞具有向上皮细胞方向分化的潜能。LI等[22]将向上皮细胞方向分化的ADSCs与膀胱脱细胞基质复合后，用于兔尿道缺损模型的替代重建，术后显示ADSCs在体内环境下能促进尿道修复部位的上皮组织再生，可抑制局部组织挛缩纤维化，证实了脂肪干细胞亦能够作为组织工程化尿道材料的种子细胞。

2 支架材料

组织工程支架材料不仅能为种子细胞生长起到定位及定向的作用[23]，还可为新的再生组织提供机械支撑使器官按照预定的结构生长，并且最近还可通过加载生物活性标记物调节细胞功能来引导组织工程器官的重建。理想的支架材料应具有：①细胞相容性良好：可复合上皮细胞和平滑肌细胞；②可降解性及降解速率可控性：本身及其降解产物在体内可吸收，不引起炎症反应和毒性反应；③生物力学性能良好：能提供足够的机械支撑促进周围组织的长入。目前应用于组织工程尿道重建的支架材料主要有三种：

2.1天然细胞外基质天然提取物如丝素蛋白、角蛋白等作为天然的生物材料，其细胞相容性良好，有利于种子细胞粘附、增殖和分化，具有无毒性，且可被活性酶识别、标记、降解，降解产物可被机体吸收等优点,而其本身的生物力学性能较差而难于塑形，各批次产品生化性质亦存在差异，在体内降解过快而不利于周围组织的长入。在前期的研究中，丝素蛋白和人发角蛋白均显示出较为优秀的组织相容性、生物降解率以及细胞粘附性，将两者进行有效的混合后，其所制备的最终材料的生物力学性能明显优于单一的蛋白提炼所制备的支架，同时原有各独立蛋白支架中优良的生物相容性被很好的保留[24-25]。但这种膜样材料在成品后往往具有一定厚度，并且缺乏适宜的孔径和孔隙率，限制了氧气和营养物质的弥散，可导致接种其上的种子细胞的生长状态受到一定影响。

2.2脱细胞基质细胞外基质衍生材料包括膀胱黏膜下脱细胞基质(bladder acellular matrix graft, BAMG)、尿道细胞外基质(urethral extracellular matrix, UECM)、小肠黏膜下基质(small intestinal submucosa, SIS)等，这类材料不仅具有最接近细胞外基质的网架结构、生物力学性能，而且含有一些内在生长因子，例如成纤维细胞生长因子，血管内皮生长因子，转化生长因子β1和上皮生长因子，这些生长因子有利于细胞粘附生长和分化[26]。然而，这些材料的主要缺点是各批次材料之间蛋白含量不一，在它们的实用性方面亦存在伦理方面的问题，由于它们大多取自猪，无法避免疾病传播的可能性。

2.3合成聚合支架材料人工合成聚合材料主要包括：聚羟基乙酸(poly glycolic acid, PGA)、聚乳酸(poly lactic acid, PLA)及二者的共聚物(poly lactic acid-co-glycolic acid, PLGA)等，主要由生物大分子共价聚合而成。由于是人工合成材料，可避免组织获取培养的难题。这种材料的优点是能够成规模低成本批量生产，其微结构、机械性能、降解率等可人为操控，能制造任何器官的三维结构，且该类材料具有良好的孔隙率，可包被产氧材料，主要经水解作用达到自身的缓释降解，降解产物物质通过与水逐步接触，可达到长效释氧的目的[27]，能够适合种子细胞在其表面和内部粘附并三维生长。缺点主要是自身降解过程中可能产生相关酸性产物，从而对生物材料及种子细胞的周边微环境产生一定影响[28]。

3 组织工程技术重建尿道

组织工程尿道技术包括单纯应用支架材料重建尿道、种子细胞与支架材料复合以后用于重建尿道。

3.1单纯应用支架材料重建尿道当有部分健康的尿道床存在时可应用单纯的支架材料重建尿道，这样就可避免种子细胞培养的难题，也可节省大量的劳动和开支，也可避免获取种子细胞带来的创伤。

刘春晓等[29]用丝素蛋白膜修复1.5 cm的兔尿道缺损获得较好效果，2003年，NUININGA等[30]采用小肠黏膜下基质(small intestinal submucosa, SIS)以镶嵌补片方式修复兔的尿道缺损(0.5～1.0 cm)获得成功。DORIN[31]等应用BAMG进行兔子尿道狭窄修复重建(<0.5 cm)的研究亦取得较为理想的效果。YANG等[32]也利用UECM补片进行了兔尿道修复重建(1.0～1.5 cm)的实验，实验结果较理想，表明单纯支架材料可用于修复短段尿道狭窄。而XIE[24]等同样应用丝素蛋白修复狗的5.0 cm的尿道黏膜缺损，6个月后尿道造影结果显示狗出现明显的尿道狭窄，组织学切片显示了明显的炎症反应，尿道上皮细胞未完全覆盖支架材料，并出现严重的纤维化，提示了丝素蛋白支架材料不可在长段尿道狭窄的修复重建中获得满意的效果。

如上所述，尽管采用单纯支架材料以补片的方式进行短段(<2.0 cm)尿道狭窄的修复已取得较好的效果，但如果尿道损伤较长(>2.0 cm)甚至闭锁，单纯的全管状材料修复会随着体内移植时间的推移可发生修复段尿道的挛缩，其原因可能是由于尿道的缺损过长，宿主的滋养血管延伸到缺损中心区域较为困难，缺乏血供的上皮细胞爬行能力减弱，难以覆盖整个创面，并且支架降解较早，宿主的自体细胞尚未完全覆盖其上所致，而复合种子细胞的移植物使长段尿道重建成为一种更好的选择[33]。

3.2种子细胞与支架材料复合以后用于重建尿道种子细胞复合支架技术被认为是管状尿道替代修复的较好选择，在大量的动物实验中显示了良好的应用效果。

FU等[14]和LI[17]等分别采用兔自体包皮表皮细胞及口腔黏膜细胞复合BAMG修复兔尿道缺损，获得成功，表明包皮表皮细胞和口腔黏膜细胞作为种子细胞复合管状脱细胞胶原基质可以成功地用于构建组织工程化尿道。 LI等[22]研究结果表明自体脂肪干细胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)复合膀胱黏膜下脱细胞基质(bladder acellular matrix graft, BAMG)用于修复兔尿道缺损获得良好效果，证实了ADSCs复合支架材料也可用于组织工程尿道重建。2013年，ORABI等[34]在一项临床前的实验中应用膀胱黏膜细胞及平滑肌细胞复合BAMG成功地修复了大量动物模型超长段尿道黏膜缺损(6 cm)，1年后行尿道造影检查结果示尿道管腔通畅，组织学亦显示植入的细胞仍然存活，并且在构成尿道管腔黏膜方面仍然发挥着作用。证实了种子细胞复合支架技术在尿道修复重建中的强大作用及良好的应用效果。

应用种子细胞复合支架技术在超长段尿道狭窄(6 cm)修复重建中获得成功,表明种子细胞复合支架技术较单纯应用支架材料修复尿道具有更好的效果，其原因可能为种子细胞为支架材料提供了避免尿液下渗到组织的屏障，可防止尿液的腐蚀作用，从而阻止尿道纤维化和尿道狭窄的发生。种子细胞复合支架技术为组织工程技术在尿道狭窄修复重建临床中的应用奠定了良好的基础。

4 组织工程技术在临床中的应用

虽然泌尿外科是第一批将组织工程技术引入临床实践的专业学科，但组织工程尿道的临床应用仍很有限。目前，组织工程尿道临床修复重建主要有两种方法：一种是单纯支架材料修复，另一种是细胞复合支架材料修复。

4.1单纯支架材料修复徐月敏等[35]采用4层猪SIS补片修复治疗前尿道狭窄(3.5～7.0 cm)患者18例，术后平均随访10个月，17例排尿均通畅，未出现再狭窄，仅1例尿道下裂患者术后5个月出现轻度尿道狭窄症状，行尿道扩张治疗后疗效满意。结果表明小肠黏膜下层可作为组织工程尿道重建材料修复部分尿道狭窄患者。但我们仍认为SIS毕竟处于临床试验阶段，还有很多问题需要解决，如狭窄部位、手术方式、合适的尿道狭窄段长度与宽度、周围海绵体纤维化情况以及重建后的长期耐受性等，临床应用SIS应严格掌握适应征。EL-KLASSABY等[36]应用人BAMG修复尿道狭窄(1.5～16.0 cm)患者28例，术后平均随访37个月，4例患者在吻合口出现狭窄，1例患者发生尿瘘但1年后自行修复，其他23例患者膀胱镜检查发现新尿道形成，活检标本组织学检查发现典型的尿道上皮。虽然文献报道中BAMG修复重建尿道的临床疗效较理想，但相关文献数量仍十分有限，尽快开展BAMG尿道构建的多中心临床对照研究，BAMG有望应用于尿道组织工程。

4.2细胞复合支架材料目前，种子细胞复合支架材料技术已被应用于三项人类实验研究，1项研究用于修复成人干燥闭塞性龟头炎(lichen sclerosis, LS)[15]患者，其余2项研究用于修复儿童后尿道狭窄和儿童尿道下裂[37-38]。在成人的研究中，自身的口腔黏膜细胞和成纤维细胞取自患者颊黏膜并种植于尿道板，1例患者需全部切除，另1例患者需局部切除，其余3例患者需要尿道扩张等操作才可维持管腔通畅，其较高的失败率可能归因于干燥闭塞性龟头炎患者本身的病理学改变和修复材料的挛缩[15]。在后尿道成形术的研究中，经活检取得5个儿童的颊黏膜组织，分离培养上皮细胞和成纤维细胞，种植于管状的PLGA支架后用于后尿道成形术，术后随访6年，效果良好，管腔通畅[37]。在儿童尿道下裂的研究中，从6个儿童的膀胱灌洗液中分离培养获得自身尿路上皮细胞并种植于脱细胞基质上，二者的复合材料用于修复6例尿道下裂的儿童患者，结果显示5例患者在尿道修复部位管腔通畅，1例发生狭窄，经过尿道内切开后管腔通畅[38]。然而，这种种子细胞复合支架技术在一些复杂性的病例中，如残废性尿道下裂、膀胱外翻及复杂性和长段尿道狭窄的修复中亦有其局限性，修复效果值得商榷。

5 结论

组织工程研究是一项不断发展的用于器官和组织替代的技术，种子细胞复合支架材料被认为是最佳的用于自身尿道狭窄修复重建的替代物。虽然组织工程技术在生物支架材料的开发、理想的种子细胞的找寻以及在支架上接种细胞构建仿真尿道等方面取得了很大的进步，但其在临床应用中的报道仍很有限。组织工程技术在临床的大规模应用前尚有很长的路要走。

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(编辑何宏灵)

收稿日期：2015-04-21修回日期：2015-09-08

通讯作者:撒应龙，主任医师．E-mail：sayinglong331@sina.com

作者简介:郭海林(1987-)，男(汉族)，硕士研究生.研究方向：尿道狭窄的修复与重建．E-mail：ghl8705@163.com

中图分类号:R699.6

文献标志码:A

DOI：10.3969/j.issn.1009-8291.2016.02.022