天然凝血酶抑制剂的研究进展

沈惠亮，吴　倩，王镜淇，龚国清

(中国药科大学药学院，江苏 南京　211198)



天然凝血酶抑制剂的研究进展

沈惠亮，吴倩，王镜淇，龚国清

(中国药科大学药学院，江苏 南京211198)

摘要：凝血酶是丝氨酸蛋白酶的一种，同时具有于抗凝和促凝活性，在血栓形成和止血过程中发挥着重要的作用。而凝血酶之所以能发挥双重作用，与其结构密切相关。因此根据凝血酶的结构特点，设计特异性、高效的凝血酶抑制剂对于更好地了解止血过程和抑制血栓的形成具有重要意义，通过查阅国内外相关文献,现就天然抑制剂对于凝血酶作用机制及其研究意义进行综述。

关键词:凝血酶；丝氨酸蛋白酶抑制剂；阴离子外部结合位点

凝血酶作为凝血瀑布中的关键环节[1-2]，发挥着抗凝和促凝的作用。具体来说，在促凝方面，凝血酶可以激活血小板，将纤维蛋白原解离成纤维蛋白，进而导致血凝块的形成，同时可以通过反馈调节激活凝血因子Ⅴ、Ⅶ、Ⅺ，进一步促进血液凝固。凝血酶的抗凝作用主要表现为，当其和内皮细胞表面的血栓调节蛋白结合时会激活蛋白C，而激活后的蛋白C(APC)可以在磷脂和钙离子存在时，灭活Ⅴa、Ⅷa,并削弱Ⅹa对凝血酶原的激活作用；同时，刺激纤溶酶原激活物的释放，增强纤溶酶活性，促进纤溶作用，综合发挥抗血栓作用。

凝血酶之所以能发挥双重作用主要是由其结构决定的。研究已证实，凝血酶通过3个重要的结构域发挥作用，即活性位点(active site)，阴离子结合位点1(anion binding exosite 1,ABE1)和阴离子结合位点2(anion binding exosite 2,ABE2)。因此，利用这些结构上的特点，人们研制了高特异性的凝血酶抑制剂。通常，凝血酶抑制剂来源于某些吸血动物唾液中，隶属于不同的蛋白家族，并且都是丝氨酸蛋白酶抑制剂。这一类抑制剂的晶体结构显示了抑制剂(多肽或蛋白)定点结合凝血酶的方式，这些抑制剂可以通过破坏凝血酶的结构，使凝血酶被血液中存在的游离辅因子或底物清除。

1凝血酶的结构和功能

1.1凝血酶的结构 凝血酶由含有49个氨基酸残基的轻链以及含有259个氨基酸的重链共价结合而成。三维结构示意图见图1。当发生自身分解反应时，会从轻链上移除13个氨基酸残基，形成α-凝血酶。凝血酶发挥作用的主要结构域是活性位点和ABE1和ABE2。其中，活性位点含有大量的负电荷，易与S1口袋中的P1精氨酸残基结合，同时，也可特异性的和“插入环”(60S和147S)结合。ABE1是位于活性位点一端的结构域，它由30S和70S环组成，ABE1是纤维蛋白原和血栓调节蛋白的结合位点，可以和大多数凝血酶特异性底物结合，比如通过直接结合(如纤维蛋白原[3]血小板相关受体-1[4]、凝血因子Ⅴ[5]和凝血因子Ⅶ[6-7])和间接结合(如蛋白C[8]和凝血因子ⅩⅢ[9])的方式。ABE2作为肝素结合位点，从凝血酶分子的顶部一直环绕至凝血酶的背面，在血小板与GP(血小板膜糖蛋白)1Bα结合以及凝血酶对某些底物的识别上发挥着重要作用。

图1　凝血酶三维结构示意图

1.2凝血酶的功能凝血酶作为体内凝血过程中的重要环节，由凝血酶原和一系列级联放大的水解反应生成，这一系列反应通常被称为凝血瀑布[10-12]。凝血瀑布由一些刺激因子诱发，如血管壁损伤后的内皮细胞，血液的高切应变力等，凝血的结果在生理条件下体现为止血，病理条件下，就会形成血栓。在初级栓子形成后，通过复杂的机制使GP1Bα与vWF(假血管性血友病因子)结合，GPVI与胶原结合，使血小板进一步黏附于损伤部位，形成牢固的止血栓子[13]。在外源凝血途径方面，凝血因子Ⅶa和细胞外的组织因子结合，启动蛋白水解瀑布；同时，结合后形成的Ⅶa-组织因子复合物可以激活因子Ⅶ和Ⅸ，可使凝血因子Ⅹ转化为Ⅹa，凝血因子Ⅹa是将凝血酶原转化成凝血酶的蛋白酶，最后再通过募集游离的辅因子和底物形成稳定的止血栓子[14]。

2天然凝血酶抑制剂

2.1天然凝血酶抑制剂概述所有的天然凝血酶抑制剂都是丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族的成员[15-16]。丝氨酸蛋白酶抑制剂有大约400个残基，包含一个混合型α/β折叠。构象稳定的丝氨酸蛋白酶抑制剂的主要由一个大的五链β片层(A片层)以及一个含有20个氨基酸残基的RCL(活性中心环)组成。凝血酶和其他蛋白酶可以与丝氨酸蛋白酶抑制剂的活性中心环结合，形成非共价复合物。这种非共价复合物的持续作用时间未知，但它可以很快转变为酰基酶中间产物。整个过程伴随着酯键和S195(第195位丝氨酸)和P1残基的酰基碳的结合。最终，丝氨酸蛋白酶抑制剂上的蛋白酶从“顶部”到“底部”迁移，形成高度稳定的六链丝氨酸蛋白酶抑制剂并导致蛋白酶空间结构的破坏[17]。同时，催化环的膨胀增大了氧离子洞并且将移除催化口袋的羰基氧。这种变化又会诱导酶原到酶的构象转换，并且使丝氨酸蛋白酶抑制剂重新恢复对其特异性酶的抑制活性。

2.2天然凝血酶抑制剂的分类和作用机制常见的四种天然丝氨酸蛋白酶抑制剂分别是：抗凝血酶(AT，或称为ATⅢ)[18]，肝素辅因子Ⅱ(HCⅡ)[19]，蛋白C抑制剂(PCI)[20]和蛋白酶连接蛋白1(PN1)[21]。这四种丝氨酸蛋白酶抑制剂，在GAGs(黏多糖类物质)存在时，抑制活性有明显增强。比如肝素，就可以在GAGs存在的条件下，同时和丝氨酸蛋白酶抑制剂以及凝血酶的外部位点2(ABE2)结合。这一机制可以使凝血酶在完整内皮周围时活性得以抑制，因为此范围充斥着许多肝素样黏多糖，从而血管壁完整时抑制血液凝固。与ABE2不同，ABE1在HCⅡ和PCI的作用下参与凝血酶的抑制。HCⅡ可以通过ABE1和P1口袋处亮氨酸残基缺口的结合而募集凝血酶，而PCI可以通过直接结合于TM的第四结构域EGF来抑制凝血酶与血栓素调节蛋白的结合过程，而非直接与凝血酶的ABE1发生作用。

丝氨酸蛋白酶抑制剂之所以能够特异性地抑制凝血酶活性的原因是它能使生成的凝血酶复合物失活。事实上，所有的丝氨酸蛋白酶抑制剂会对丝氨酸蛋白酶造成一定程度上的解折叠，从而使其丧失原有功能。而丝氨酸蛋白酶抑制剂的抑制能力在微观上取决于施加的破碎力，这种破碎力由RCL的长度(更短则力更大，更长则力更小)和活性位点的深度决定。在结构上，凝血酶的插入环能明显提高破碎力，导致更大程度解折叠的发生。在丝氨酸蛋白酶—丝氨酸蛋白酶抑制剂复合物中，两个凝血酶外部位点均呈现无规则和无功能状态[22]。这一特性确保了凝血酶—丝氨酸蛋白酶抑制剂复合物会与所有辅因子或底物(例如TM，GAGs，纤维蛋白)分离，且可以自由分布在血液中。而这种自由的分布与丝氨酸蛋白酶抑制剂—凝血酶复合物在肝脏受体的清除率有一定联系。

3天然凝血酶抑制剂研究现状

3.1抗凝血酶抗凝血酶是体内主要的凝血酶抑制剂，其在血液中的浓度可达2.5 μmol·L-1。一方面，ATⅢ中的精氨酸可以和凝血因子Ⅱ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ中的丝氨酸1∶1结合，使其失活，另一方面，其含有的带正电荷的赖氨酸可以和带负电荷的肝素结合，暴露精氨酸，使ATⅢ对凝血因子的抑制速率增大1 000倍。但由于它也可以同时抑制多种凝血因子,所以并不是凝血酶特异性抑制剂。近期研究还发现[23]，ATⅢ和蛋白多糖-4的结合可以增加PG(前列腺素)I2的含量，进而下调促炎因子的生成，在炎症反应中也发挥一定作用。

3.2 肝素辅因子Ⅱ肝素辅因子Ⅱ是凝血酶众多底物或抑制剂中唯一的不含精氨酸和P1口袋的凝血酶抑制剂。HCⅡ在血液中浓度约为1.2 μmol·L-1，其抑制凝血酶的速率较慢。肝素，硫酸乙酰肝素都可以通过暴露天然丝氨酸蛋白酶抑制剂末端的部分使HCⅡ的活性增大1 000倍。HCⅡ在凝血过程中没有ATⅢ重要，但它可能作为一种重要的后备力量，当其含量升高时，可以缓解埋置冠脉支架后的血管再狭窄现象[24]。

3.3蛋白C抑制剂PCI可以由许多类型的细胞表达并存在于多数组织中。同ATⅢ一样，PCI除了对凝血酶有抑制作用外，还可以抑制Xa, VⅡa-组织因子复合物，活化蛋白C等，这一特点也使它成为同时具有抗凝和促凝作用的丝氨酸蛋白酶抑制剂。有趣的是，在对PCI的研究过程中发现，由于并不能在小鼠的肝中检测到PCI的存在，说明小鼠血液循环中不含有PCI，因此在前期动物试验中不能借助小鼠来模拟PCI在人类止血过程中发挥的作用。和ATⅢ和HCⅡ不同，PCI对凝血酶的抑制效应并不因肝素的存在而显著增加，而血栓素调节蛋白(TM)的含量也会影响到PCI的抑制作用，因此PCI还可以通过抑制凝血酶和TM的结合而发挥作用。近期还有研究表明，PCI和以和肝细胞生长因子激活物(HGFA)结合，对组织产生一定的修复和调控作用[25]。

3.4蛋白酶连接蛋白1PN1是所有丝氨酸蛋白酶抑制剂中效能最高的抑制剂，在肝素存在时，其二级动力学常数高达1.5×106mol ·L-1·s-1。与其他可与肝素结合的丝氨酸蛋白酶抑制剂不同，PN1并不由肝产生，而是通过巨噬细胞，血小板和平滑肌细胞产生，它和GAG的亲和力较弱，而且对最后形成的PN1-凝血酶复合物毫不敏感，因此，最终生成的复合物并不由肝清除，而是由所附着的细胞清除。

4凝血酶抑制剂的研究意义

血栓性疾病是困扰人类健康的一大类疾病，对于该疾病的治疗主要从抗血小板[26]和抗凝血两个方面进行。在抗血小板方面，主要通过抑制环氧化酶-1(COX-1)和血小板ADP受体来发挥作用[27]，代表药物分别是阿司匹林和氯吡格雷，而最新研究发现两者都会有一定的抵抗作用[28]。在抗凝血方面，主要是通过抑制凝血瀑布的级联放大作用，尤其对关键凝血因子的抑制(如凝血因子X，凝血酶)而产生治疗作用，对应的药物有利伐沙班，达比加群酯等[29]。与此同时，一些新的检测手段，如血管弹力图，在评价凝血和纤溶能力时也起了重要的作用。

在血栓性疾病的发生发展过程中，凝血酶可以催化纤维蛋白原生成纤维蛋白，并通过正反馈机制进一步促进自身的生成，最终形成稳定的栓子。相对于间接凝血酶抑制剂，直接凝血酶抑制剂不依赖于抗凝血酶，可以和任何形式的凝血酶结合[30]，包括已形成的凝血酶—底物/辅因子复合物，从而使处于不同凝血阶段的凝血酶失活。同时，相对于维生素K拮抗剂华法林来说，因为直接凝血酶抑制剂对凝血瀑布的其他维生素K依赖性凝血因子无抑制作用，从而降低了出血风险[31]。

5结论与展望

通过对现有的天然凝血酶抑制剂及其作用机制的深入研究，阐明抑制剂如何通过利用凝血酶独特的结构特性实现高效能和高选择性。我们可以得出结论：凝血酶抑制剂的作用总是需要ABE1或ABE2的参与，这两个结构域对凝血酶的活性具有调控作用，可以通过大面积的“静电操控”引导抑制剂的以特定方式插入活性位点。因此，在今后对凝血酶抑制剂的开发过程中，可以在设计层面更多地考虑其对ABE1和ABE2的作用，从而间接影响凝血酶的生理活性。

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Research advances of natural thrombin inhibitors

SHEN Hui-liang ,WU Qian ,WANG Jing-qi, et al

(DepartmentofPharmacy,ChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing,Jiangsu211198，China)

Abstract:Thrombin is one of serine proteases which exerts vital function in both thrombosis and hemostasis owing to its antithrombotic and procoagulant activities.The dual effects of thrombin have close relationship with its structure.It is of great significanceto design specific and efficient thrombin inhibitors to better understand the process of hemostasis as well as inhibition of blood clots formation.By reviewing the relevant literatures, the mechanism of natural thrombin inhibitors were thus reviewed.

Key words：thrombin;serpin;anion binding exosite

(收稿日期：2015-11-13，修回日期：2015-12-20)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.04.002

作者简介：沈惠亮，男，硕士研究生通信作者：龚国清，男，副教授，硕士生导师，研究方向：创新化合物的抗血栓作用及其机制研究，E-mail:gonggq@hotmail.com

基金项目：国家自然科学基金(No 59637050)