熊果酸对人上皮性卵巢癌SKOV3细胞增殖和凋亡的影响

王丽琴

(武安市第一人民医院妇科，河北 武安　056300)



熊果酸对人上皮性卵巢癌SKOV3细胞增殖和凋亡的影响

王丽琴

(武安市第一人民医院妇科，河北 武安056300)

摘要：目的研究熊果酸(UA)对人上皮性卵巢癌SKOV3细胞增殖和凋亡的影响，并探讨其可能的作用机制。方法将处于对数生长期人上皮性卵巢癌SKOV3细胞随机分为5组：正常对照组、熊果酸(40、20、10 mg·L(-1))干预组和顺铂(40 mg·L(-1))干预组(阳性对照组)。药物干预48 h后，通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法测定细胞增值抑制率；通过流式细胞仪分析细胞周期的改变、观察细胞凋亡并计算细胞凋亡率；通过RT-PCR技术检测细胞Bax mRNA和bcl-2 mRNA表达并计算Bax/bcl-2表达比值，Western blot法检测细胞半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)蛋白表达并进行半定量分析。结果较正常对照组，熊果酸(40、20 mg·L(-1))干预组细胞增殖抑制率显著升高(P<0.01)，细胞周期被阻滞于G2/M期，细胞凋亡率显著升高(P<0.01)；熊果酸(40、20 mg·L(-1))干预组细胞中bcl-2 mRNA表达显著下调、Bax mRNA表达显著上调，Bax/bcl-2表达比值显著升高(P<0.01)，caspase-3蛋白表达显著上调(P<0.01)。结论熊果酸具有抑制人上皮性卵巢癌SKOV3细胞增殖并促进其凋亡的作用，其作用机制可能与熊果酸能够有效下调bcl-2 mRNA表达、上调Bax mRNA表达、提高Bax/bcl-2表达比值以及上调caspase-3蛋白表达有关。

关键词：熊果酸；上皮性卵巢癌；SKOV3细胞；增殖；凋亡

由于早期诊断率低，卵巢癌死亡率高居众多妇科恶性肿瘤之首，年死亡率约9.5/10万[1]。目前，临床上主要采取手术清除结合术后化疗的手段治疗卵巢癌，能够相对延长患者生命，但3年复发率仍高于50%，5年生存率仍不到30%；学者[2-3]研究发现，耐药性的产生是导致化疗失败和肿瘤复发的主要原因之一。因此，研发药效优良且抗耐药的新型药物是延缓卵巢癌的关键。熊果酸(Ursolic Acid, UA)是一种天然存在的五环三萜类化合物，主要存在于熊果、夏枯草、女贞子等植物中。现代药理学研究表明，熊果酸具有抗氧化、抗炎、降血脂、抗病毒等多种生物活性[4-5]，毒副作用低，具有良好的临床应用开发前景。本实验通过使熊果酸干预人上皮性卵巢癌SKOV3细胞，并以顺铂干预组为阳性对照，研究熊果酸对人上皮性卵巢癌SKOV3细胞增殖和凋亡的影响，并探讨其可能的作用机制。

1材料与方法

1.1药物与试剂熊果酸(陕西慧科植物开发有限公司，批号：140519，纯度≥98%)；注射用顺铂(山东齐鲁制药有限公司，每支10 mg)；PBS溶液(博士德太原分公司)；RPMI-1640培养基(美国JRH公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；四甲基偶氮唑盐试剂盒(MTT，美国Sigma公司)；Annexin V/PI细胞凋亡检测试剂盒(德国Bendermed公司)；RNA提取TRIzol试剂盒(北京TransGen公司)；cDNA逆转录试剂盒(上海斯信生物科技有限公司)；bcl-2、bax的上下游引物(上海博亚生物公司)；羊抗人caspase-3单体(碧云天生物技术有限公司)；SP法试剂盒(南京建成生物工程研究所)；其余试剂均为分析纯。

1.2细胞人上皮性卵巢癌SKOV3细胞株由北京肿瘤医院惠赠。

1.3主要仪器超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；BB5060/BB16型恒温CO2细胞培养箱(美国forma scientific公司)；iMark型酶标仪、PCR仪(美国 Bio-Rad公司)；流式细胞仪(美国BD公司)；DYY-11 型多用电泳仪、DYCZ-40B 转印泳槽(北京六一仪器厂)；倒置光学显微镜(日本Olympus公司)。

1.4方法

1.4.1细胞培养与分组将实验用细胞株经解冻复苏后置于RPMI-1640培养基中进行培养，待细胞生长繁殖至对数生长期，去培养液加0.25%胰酶进行消化，调整细胞浓度至5×107·L-1，培养24 h后随机分为正常对照组、熊果酸(40、20、10 mg·L-1)干预组和顺铂(40 mg·L-1)干预组(阳性对照组)，每组均给药干预48 h后进行相关指标检测。

1.4.2细胞增值抑制率测定调整细胞浓度至5×107·L-1后接种于96孔板，每组设10个复孔，每孔加入20 μL MTT溶液(5 g·L-1)，培养4 h后去上清液，每孔加入二甲基亚砜(DMSO) 200 μL，振荡10 min后通过酶标仪测定波长570 nm处吸光度(OD)值，然后计算各组细胞增殖抑制率：细胞增殖抑制率(%)=[1-(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)]×100%。

1.4.3细胞周期及细胞凋亡的检测取约1×106细胞，10 000 rpm离心5 min后弃上清液，PBS洗涤，加70%乙醇5 mL混匀，于4℃环境放置48 h后，离心去除乙醇，PBS洗涤后1 mL PBS溶液打散细胞团后加5 μL水解酶Rnase(10 g·L-1)，37℃放置1 h后加入碘化丙啶(100 mg·L-1)染液，室温避光孵育30 min，然后通过FACS-FITC和PI联合染色流式细胞仪进行分析检测，采用CELL Quest软件分析各组细胞的细胞周期时相及凋亡状况。

1.4.4细胞中bcl-2 mRNA、bax mRNA表达的检测及Bax/bcl-2表达比值的计算从基因文库中查询大鼠bcl-2、bax基因cDNA序列，应用Oligo软件设计上、下游引物；bcl-2引物：上游5'-GGGATGCCTTTGTGGAACTA-3'，下游5'-TGATTTGACCATTTGCCTGA-3'；bax引物：上游5'-ATCCAGGATCGAGCAGGGAGGATGG-3'，下游5'-AGATGGTCACTGTCTGCCA TGTGGG-3'；β-actin引物：上游5'-CCTGTATGCCTCTGGTCGTA-3'，下游 5'-CCATCTCTTG CTCGAAGTCT-3'。经药物干预48 h后，经0.25%胰酶消化并收集各组细胞，加入适量TRIzol试剂提取总RNA并测定总RNA浓度，反转录为cDNA后进行PCR反应，扩增完毕后取PCR产物于琼脂糖凝胶电泳，最后通过凝胶成像仪观察并照相。以β-actin为内参，半定量分析bcl-2 mRNA、bax mRNA表达，计算Bax/bcl-2表达比值。

1.4.5细胞中caspase-3蛋白表达的检测离心取各组细胞，经PBS溶液洗涤3次后超声碎裂细胞，12 000 rpm低温(4℃)离心20 min取沉淀，通过BCA法进行蛋白定量，蛋白变性后上样、电泳：待溴酚蓝接近胶底部时停止、转膜、春红溶液染色，室温下5%脱脂奶粉封闭2 h，一抗(caspase-3，β-actin) 4℃过夜；洗膜，二抗室温摇床上孵育1 h后经ECL显色，实验结果应用Quantity One软件进行分析。

2结果

2.1熊果酸对细胞增殖抑制率的影响熊果酸各干预组和顺铂干预组SKOV3细胞增殖抑制率较正常对照组均显著升高(P<0.01)；且熊果酸40 mg·L-1干预组SKOV3细胞增殖抑制率显著高于顺铂干预组(P<0.05)，结果见表1。

表1　熊果酸对人上皮性卵巢癌SKOV3细胞增殖

注：与正常对照组比较，**P<0.01；与顺铂干预组比较，△P<0.05。

2.2熊果酸对细胞细胞周期的影响熊果酸(40、20 mg·L-1)干预组和顺铂干预组SKOV3细胞G0/G1期较正常对照组显著缩短且G2/M期显著延长(P<0.01)，但熊果酸(40、20 mg·L-1)干预组和顺铂干预组间无显著性差异(P>0.05)，提示熊果酸能够将SKOV3细胞周期阻滞于G2/M期，从而抑制细胞增殖，结果见表2。

2.3熊果酸对细胞凋亡的影响通过流式细胞仪分析发现，熊果酸干预组和顺铂干预组人上皮性卵巢癌SKOV3细胞凋亡状况较正常对照组明显加重，见图1；计算凋亡率发现，熊果酸各干预组和顺铂干预组细胞凋亡率均显著升高(P<0.01)，且熊果酸40 mg·L-1干预组细胞凋亡率较顺铂干预组显著升高(P<0.01)，结果见表3。

表2　熊果酸对人上皮性卵巢癌SKOV3细胞

图1　熊果酸对人上皮性卵巢癌SKOV3细胞凋亡的影响

注：A.正常对照组；B.熊果酸40 mg·L-1干预组；C.熊果酸20 mg·L-1干预组；D.熊果酸10 mg·L-1干预组；E.顺铂40 mg·L-1干预组。

表3　熊果酸对人上皮性卵巢癌SKOV3细胞

注：与正常对照组比较：**P<0.01；与顺铂干预组比较：△△P<0.01。

2.4熊果酸对细胞中bcl-2 mRNA、Bax mRNA表达和Bax/bcl-2表达比值的影响通过RT-PCR分析发现，熊果酸40 mg·L-1干预组bcl-2 mRNA表达较正常对照组显著降低(P<0.01)，而熊果酸(40、20 mg·L-1)干预组和顺铂干预组Bax mRNA表达均显著升高(P<0.01)、Bax/bcl-2比值显著升高(P<0.01)；熊果酸40 mg·L-1干预组Bax/bcl-2表达比值较顺铂干预组显著升高(P<0.05)，结果见表4。

2.5熊果酸对细胞caspase-3蛋白表达的影响通过Western blot方法测定细胞中caspase-3蛋白表达：发现熊果酸(40、20 mg·L-1)干预组和顺铂干预组人上皮性卵巢癌SKOV3细胞caspase-3蛋白表达量较正常对照组显著升高(P<0.01)；且熊果酸40 mg·L-1干预组细胞中caspase-3蛋白量显著高于顺铂干预组(P<0.05)，结果见图2和表5。

表4　熊果酸对人上皮性卵巢癌SKOV3细胞

注：与正常对照组比较，*P<0.05,**P<0.01；与顺铂干预组比较：△P<0.05。

图2　熊果酸对人上皮性卵巢癌

注：与正常对照组比较，**P<0.01；与顺铂干预组比较，△P<0.05。

3讨论

卵巢癌、宫颈癌和子宫内膜癌是女性生殖系统常见三大恶性肿瘤，其中卵巢癌的发病率居第2位；但由于早期诊断率低，年死亡率达9.5/10万，居众多妇科恶性肿瘤之首[6]。目前，临床上对于卵巢癌的治疗仍以手术切除联合术后化疗为主，但5年生存率不足30%，其中肿瘤细胞耐药性的产生是导致化疗失败和肿瘤复发的主要原因之一[2-3, 7]。因此，迫切需要研发疗效良好且抗耐药的新型药物。

熊果酸(Ursolic Acid, UA)是一种具有多种药理学活性的五环三萜类化合物。近年来关于熊果酸抗癌活性的研究越来越受到广大学者的灌注，张明发[8]和黄之虎[9]等研究发现，熊果酸能够通过调节凋亡相关基因的表达而诱导白血病细胞凋亡；徐新伟[10]和马于平[11]等通过熊果酸干预乳腺癌细胞进行研究，发现熊果酸能够抑制乳腺癌细胞增殖并促进其凋亡。本研究以人上皮性卵巢癌SKOV3细胞株为受试细胞并以顺铂干预组为阳性对照进行研究，MTT实验结果显示，经熊果酸干预能够显著提高SKOV3细胞增殖抑制率，并且熊果酸40 mg·L-1干预组效果显著优于顺铂干预组；流式细胞术分析结果显示，经熊果酸干预能够将SKOV3细胞阻滞于G2/M期并提高SKOV3细胞凋亡率，并且熊果酸40 mg·L-1干预组细胞凋亡率显著高于顺铂干预组，提示熊果酸具有抑制人上皮性卵巢癌SKOV3细胞增殖并促进其凋亡的作用。

bcl-2和Bax均为bcl-2基因家族成员，其中bcl-2为凋亡抑制基因、Bax为促凋亡基因，二者相互作用、共同调控细胞凋亡[12-13]；并且细胞凋亡不仅仅与bcl-2和Bax基因表达密度相关，甚至更依赖于bcl-2/Bax表达比值[14]。Caspases基因家族是细胞凋亡过程中非常重要的调控基因，其中caspase-3被认为是各种凋亡刺激因子激活的关键蛋白酶。本研究结果显示，熊果酸能够显著下调人上皮性卵巢癌SKOV3细胞中bcl-2基因表达、同时上调Bax基因表达、提高Bax/bcl-2表达比值，并上调caspase-3蛋白表达，这可能是熊果酸抑制人上皮性卵巢癌SKOV3细胞增殖并促进其凋亡作用重要的分子机制之一。

因此，熊果酸具有抑制人上皮性卵巢癌SKOV3细胞增殖并促进其凋亡的作用；其作用机制可能与熊果酸能够有效下调bcl-2 mRNA表达、上调 Bax mRNA表达、提高Bax/bcl-2比值以及上调caspase-3蛋白表达有关。

参考文献：

[1]Jemal A,Siegel R,Xu J,et al. Cancer Statistics, 2010[J]. Ca Cancer Journal for Clinicians, 2010, 60(5): 277-300.

[2]孙丽丽,贾薇,常彬.卵巢癌化疗耐药机制研究进展[J].临床与实验病理学杂志, 2013, 29(11): 1229-1231.

[3]吴翌楠,王苏立,王迎春,等.DHA 逆转卵巢癌细胞A2780/T紫杉醇耐药的机制研究[J]. 东南大学学报(医学版), 2015, 34(5): 689-695.

[4]彭海兵,储金秀,曹福源,等.熊果酸对矽肺大鼠的早期抗氧化作用[J].环境与职业医学, 2015, 32(5): 476-480.

[5]刘红,靳学远,秦霞,等.熊果酸葡萄糖酯的制备及降血脂作用研究[J].安徽农学通报,2013,19(10): 22-23.

[6]叶亚琳,王玉亮,王泽剑,等.青蒿琥酯和熊果酸降血脂作用的最佳配比筛选[J].药学实践杂志,2014,32(3): 195-198.

[7]Jemal A,Siegel R,Xu J,et al.Cancer Statistics,2010[J].Cancer Journal for Clinicians, 2010, 60(5): 277-300.

[8]张明发,沈雅琴.熊果酸和齐墩果酸抗皮肤癌与白血病药理作用的研究进展[J].抗感染药学,2012,9(3):177-181.

[9]黄之虎,农朝赞,农少云,等.miR-203提高白血病K562细胞对熊果酸的敏感性研究[J].中国药理学通报,2014,30(7):969-972.

[10] 徐新伟,郭玲玲,顾振纶,等.乳腺癌中COX-2、Bax、Bcl-2的表达及熊果酸的干预作用[J].苏州大学学报(医学版),2012,32(4):528-530.

[11] 马于平,孙圣荣.熊果酸对乳腺癌细胞凋亡影响及其机制[J].辽宁中医药大学学报,2014,16(8):59-62.

[12] 朱玲,罗颂平,许丽绵,等.左归丸对免疫性卵巢早衰小鼠卵巢 Bcl- 2、Bax蛋白表达的影响[J].中药新药与临床药理, 2012,23(4):381-386.

[13] 赵志明,杜元杰,左一鹏,等.中药何首乌饮对大鼠卵巢颗粒细胞凋亡相关蛋白bcl-2, bax表达的影响[J].现代中西医结合杂志,2012,21(23):2530-2532.

[14] 杨洋博君,王爽,李舒,等.复方大七气汤联合顺铂对裸鼠卵巢癌皮下移植瘤Bcl-2/Bax表达的影响[J].中国中药杂志,2015,40(8):1575-1578.

Effects and mechanism of ursolic acid on the proliferation and apoptosis of epithelial ovarian SKOV3 cancer cell

WANG Li-qin

(DepartmentofGynecology,Wu’anFirstPeople’sHospital,Wuan,Hebei056300,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effects and mechanism of ursolic acid(UA) on the proliferation and apoptosis of epithelial ovarian SKOV3 cancer cell. Methods The Logarithmic epithelial ovarian cancer SKOV3 cells were randomized into five groups:normal control group, UA(40、20、10 mg·L(-1)) groups and Cisplatin 40 mg·L(-1) group. 48 h later, the cellular growth inhibition rate was calculated by MTT, cell cycle and apoptosis rates were analyzed by flow cytometry, the expression of Bax mRNA and bcl-2 mRNA were detected by RT-PCR, the level of caspase-3 protein expression was detected by Western blot. ResultsCompared with normal control group, the cellular growth inhibition rates of UA(40、20 mg·L(-1)) groups were significantly increased(P<0.01); the cell cycle was arrested at G2/M phase, the apoptosis rate was significantly increased(P<0.01); the expression of bcl-2 mRNA was significantly decreased, while the expression of Bax mRNA was significantly increased, and the ratio of Bax/bcl-2 was significantly increased(P<0.01); the expression of caspase-3 protein was significantly increased (P<0.01). ConclusionsUA could effectively inhibit epithelial ovarian SKOV3 cancer cell proliferation and promote its apoptosis, which was perhaps related to its effects of downregulating the expression of bcl-2 mRNA, raising the expressions of Bax mRNA and caspase-3, and enhancing the ratio of bcl-2/Bax.

Key words:ursolic acid;epithelial ovarian cancer;SKOV3 cell;proliferation; apoptosis

(收稿日期：2015-11-10，修回日期：2016-01-12)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.04.009