bHGA对体外培养成骨细胞活性的影响

王朝元，刘亮亮

(中南民族大学 生命科学学院，武汉 430074)



bHGA对体外培养成骨细胞活性的影响

王朝元，刘亮亮

(中南民族大学 生命科学学院，武汉 430074)

摘要为探讨12b-羟基-去-D-杰氏山竹子素A(bHGA)的体外潜在成骨活性，用bHGA处理MC3T3-E1成骨细胞，研究了其对细胞碱性磷酸酶活性、矿化、骨相关基因表达及早期成骨分化相关基因表达水平的影响.结果表明：bHGA处理细胞后，对Runx2 mRNA表达无显著影响，而对OsxmRNA的表达具有一定抑制作用.bHGA能同时促进骨钙蛋白基因OCN和Ⅰ型胶原Col1 mRNA的表达，但抑制碱性磷酸酶 mRNA的表达，其对骨桥蛋白基因OPNmRNA的表达没有显著影响.说明bHGA不利于骨早期分化，但它通过促进骨钙蛋白和I型胶原mRNA的表达而促进骨成熟.

关键词12b-羟基-去-D-杰氏山竹子素A；成骨活性；骨相关基因；成骨分化相关基因

人面果(Garciniaxanthochymus)是我国的一种传统傣药，是藤黄科藤黄属植物，一般生长于海拔100～1000 m的丘陵、沟谷和潮湿的密林中，在我国其主要分布于云南省南部及西南部.作为传统中药，它具有清热退火，消肿止痛，活血化瘀的疗效，可用于跌打损伤，风湿关节疼痛的治疗[1].它含有二苯甲酮衍生物、黄酮、三萜和口山酮类等化合物，其中一些化合物具有广泛的生物活性，如抗氧化、抗糖尿病、抗菌、抗细胞毒素和抗HIV病毒等[2]. 12b-羟基-去-D-杰氏山竹子素A为黄色无定形固体，是从傣药人面果中提取的药物小分子化合物, 具有抗菌、抗肿瘤作用[3]，其成骨生物活性尚不清楚.本文通过对其进行了体外成骨活性的相关测试，为中药人面果临床上的应用奠定一定的理论基础.

1材料和方法

1.1材料和仪器

小鼠原成骨细胞MC3T3-E1购自武汉大学典型培养物保藏中心，α-MEM 培养基(Thermo 赛默飞世尔生化制品有限公司)，胎牛血清(杭州四季青公司)，0.25% 胰蛋白酶(Thermo)，Alamar Blue 试剂盒(北京泛博生物化学有限公司)，碱性磷酸酶试剂盒(南京建成生物工程研究所)，SYBR Green 荧光染料(日本 TOYOBO 公司)，反转录试剂盒(Thermo).

细胞培养瓶, 96 孔、24 孔、6 孔培养板，酶联免疫分析仪(MULTISKAN ASCENT 354 型，Thermo)，CO2培养箱(HF90/240 型，利康生物医疗科技控股集团)，凝胶成像分析仪(JS-380A，上海培清科技)，荧光定量PCR仪(ABI7500Fast，美国应用生物系统公司).

1.2bHGA的结构

从云南西双版纳收集的人面果中分离提取bHGA，其分子结构见图1，分子量为442，通过NMR，质谱，HRMS数据鉴定得到[4].

图1　bHGA的分子结构Fig.1　Molecular structure of bHGA

1.3bHGA储存液的配制

将bHGA溶于DMSO，60℃加热30 min助溶，制得初始浓度为16 mM的贮存液，保存在-20℃备用.

1.4细胞培养基

基础培养基：10%胎牛血清的α-MEM培养基加入100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素.诱导培养基：在基础培养基中加入终溶度为50 μg/mL抗坏血酸、10-8mol/L地塞米松、10 mmol/L的β-甘油磷酸钠.

1.5bHGA细胞毒性的测试

用Alamar Blue实验检测bHGA对细胞存活率的影响[5]. MC3T3-E1细胞以1×103/孔的密度接种于96孔板中，细胞粘附后换用含不同浓度bHGA的诱导培养基(bHGA终浓度分别为0, 2, 4, 8, 16 μM)，每组设3个平行样，将培养板放置于37℃，5% CO2培养箱中培养0，24，72 h，每孔加入18 μL的Alamar Blue试剂使其最终体积分数为10%，黑暗条件孵化4 h，用荧光酶标仪于540 nm检测光吸收值(激发光544 nm,发射光590 nm)，以0.5% DMSO为阴性对照.

1.6bHGA对成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响

将MC3T3-E1细胞按1×104/孔接种于24孔板中，每孔加入2 mL诱导培养基.细胞粘附后，加入bHGA(终溶度为2，4，8 μM)，每组设3个重复, 含0.5% DMSO诱导培养基作为阴性对照. 培养细胞8 d、16 d，每孔加入600 μL的0.1% Triton PBS裂解液，4℃放置12 h裂解细胞，用碱性磷酸酶试剂盒检测细胞碱性磷酸酶活性.

1.7bHGA对成骨细胞体外矿化的影响

将MC3T3-E1细胞按7.5×103/孔接种于48孔板中，分别加入含有3种不同浓度bHGA(bHGA终浓度为2，4，8 μM)的诱导培养基，以含0.5% 的DMSO作为阴性对照，每组设3个平行样，培养细胞没2～3 d更换一次培养基, 分别培养8 d和16 d后，用PBS将样品洗2次.室温条件下，加入-20℃冰冷的甲醛固定细胞10 min，用dH2O洗2次，加入1% 茜素红孵化10 min，用dH2O洗若干次后风干，置倒置显微镜下观察.

为了定量测定细胞矿化，在每孔中加入10% 的乙酸800 μL，室温放置30 min，间歇震荡.后用细胞刮刀刮下细胞，加入10% 的醋酸，漩涡震荡30 s，再加入200 ～300 μL矿物油覆盖，加热至85℃，10 min，转移至冰上5 min, 20000 r/min离心15 min.取每管上清液300～400 μL转移至新的1.5 mL的离心管中，加入体积分数为10% 的氢氧化铵200 μL中和酸，取上清液150 μL转移至96孔板中于405 nm检测吸光值.

1.8bHGA对成骨细胞骨分化相关基因表达的影响

将MC3T3-E1细胞按7.5×103/孔接种于48孔板中，加入含有bHGA的诱导培养基(bHGA的终浓度为2，4，8 μM)，每组3个重复，0.5% 的DMSO为阴性对照.培养8 d和16 d，收集细胞，用Trizol法裂解细胞提取总RNA[6].按试剂盒说明书反转录成cDNA第一条链.荧光定量PCR的引物[7]见表1，GAPDH为内参基因.PCR循环参数如下：初始变性：95℃，10 min；变性：95℃，15 s；退火和延伸：60℃，60 s；循环数：45.用软件SDS2.2.2处理数据，通过2-△△CT计算相关基因表达影响[8].

表1　PCR引物序列

1.9统计分析

采用t-检验法(student′s t-test)对实验数据进行显著性差异分析，置信度p取值0.05.

2结果与分析

2.1bHGA对细胞存活率的影响

bHGA对体外培养成骨细胞增殖的影响结果如图2.如图2所示，到第3 d，不同浓度bHGA(0～16 μM)与对照组相比，16 μM组对成骨细胞具有较强细胞毒性.故选定3种浓度(2，4， 8 μM)用于后续细胞成骨活性实验.

图2　bHGA对体外培养成骨细胞增殖的影响(n=3)Fig.2　Effect of bHGA on osteoblast viability in vitro

2.2bHGA对成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响

bHGA对成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响结果见图3，如图3所示，与对照组相比，4 μM和8 μM bHGA处理8 d显著抑制了细胞内碱性磷酸酶的活性.但处理16 d后，3种浓度的bHGA对细胞碱性磷酸酶活性无明显抑制.说明这些浓度的bHGA对成骨细胞的碱性磷酸酶活性存在短期抑制作用.

与对照比较,*p<0.05, n=3图3　bHGA对体外培养成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响Fig.3　Effect of bHGA of different concentrations on osteoblastalkaline phosphatase activity in osteoblasts in vitro

2.3bHGA对体外培养成骨细胞基质矿化的影响

2、4、8 μM三种浓度bHGA处理细胞8 d后, 所测A405平均值分别为0.11、0.12、0.13, 处理16 d后A405平均值分别为1.13、0.98、1.0.其中对照组8 d 和16 d A405平均值分别为0.11和1.10.三种浓度bHGA处理结果与对照组相比，不存在显著性差异，未影响细胞外基质的矿化.

2.4bHGA对体外培养成骨细胞骨相关基因mRNA表达的影响

骨生长期间，一系列骨相关基因的表达水平能反映出成骨细胞的成骨活性状况.本研究结果中，bHGA对成骨细胞的碱性磷酸酶mRNA表达具有一定的抑制作用(见图4).培养8d和16 d后，各实验组的碱性磷酸酶mRNA均显著低于对照组(p<0.05，p<0.01，见图4a).bHGA对成骨细胞的I型胶原及骨钙蛋白mRNA表达均具有显著的促进作用(p<0.05，p<0.01)，见图4b，4d).bHGA对骨桥蛋白mRNA的表达无显著影响(p>0.05，见图4c).bHGA对成骨细胞骨涎蛋白mRNA表达则具有一定时间依赖性，长时间处理(16 d)可以促进其表达(p<0.05)，短期处理(8 d)则无显著影响(p>0.05，见图4e).

与对照组比较，*p<0.05；**p<0.01, n=3a) 碱性磷酸酶；b) 骨钙蛋白；c) 骨桥蛋白；d) I型胶原；e) 骨涎蛋白图4　bHGA对体外培养成骨细胞骨相关基因mRNA表达的影响Fig.4　Effect of bHGA on bone-related mRNA expression in osteoblasts in vitro

同时，研究了bHGA对早期成骨分化相关基因Runx2、Osx及BMP2 mRNA的表达的影响(如图5).bHGA对Runx2 mRNA表达似乎没有影响(仅在高浓度bHGA长期处理是显示出一定的抑制作用，如图5a所示.与Runx2不同，bHGA对OsxmRNA表达具有显著的抑制作用，如图5b所示.bHGA对BMP2 mRNA的影响具有一定的时间依赖性，2 μM及4 μM bHGA长期处理可以一定程度上提高BMP2的表达，如图5c所示.

a)Runx2；b)Osx；c)BMP2与对照组比较，*p<0.05,**p<0.01, n=3图5　bHGA对体外培养成骨细胞成骨分化相关基因表达的影响Fig.5　Effect of bHGA on expression of osteogenic differentiaton-related genes in osteoblasts in vitro

3讨论

生物体内成骨细胞的发育分为3个阶段：前成骨细胞的分化阶段(Runx2和Osterix参与)，骨基质形成阶段(APL，Col1，OPN，OCN和BSP等参与)和骨基质矿化阶段.在骨细胞成熟阶段中，骨相关基因的表达对骨基质和骨基质钙化的形成起着关键性的作用[9,10].

Runx2和Osx是早期骨原细胞分化为成骨细胞过程中的两个关键基因[11,12].Runx2通过结合到Osx基因的启动子上，促进MSC(间充质干细胞)表达Osterix，最终使MSC分化为前成骨细胞或骨细胞[13].Osterix是一种成骨细胞特异性转录因子，它只在骨组织发育阶段和成骨细胞中表达[14].本研究中, bHGA对Runx2基因mRNA表达影响不大，但是对Osx的表达具有一定的抑制作用，这表明bHGA是不利于充质干细胞分化形成早期成骨细胞，具体作用机制尚不明确.

骨相关基因在骨基质形成过程中起着关键作用[15].本研究发现，bHGA显著的促进I型胶原和骨钙蛋白的表达.I型胶原是骨的主要有机成分，骨钙蛋白也是成骨晚期表达的主要成分之一[16].因此，bHGA对于成骨晚期具有显著的促进作用.

碱性磷酸酶活性是早期成骨细胞的标志之一[17]，在成骨早期高度表达，随后会逐渐降低表达水平.在研究bHGA对碱性磷酸酶mRNA表达的影响时发现，bHGA对碱性磷酸酶mRNA具有显著的抑制作用，但bHGA对成骨细胞碱性磷酸酶活性无明显影响.说明bHGA可能通过调控碱性磷酸酶mRNA表达之外的其他途径调控碱性磷酸酶活性.

综上研究结果表明：bHGA对成骨的晚期，即骨基质的形成和钙化具有显著的促进作用，但是在其应用的早期会对基质干细胞向成骨细胞分化，以及成骨细胞早期的活性有一定的不利影响.

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Effects of bHGA on Activity of Cultured Osteoblastsinvitro

WangChaoyuan,LiuLiangliang

(College of Life Sciences, South-Central University for Nationalities, Wuhan 430074, China)

AbstractTo study the potential osteogenetic activity of 12b-hydroxy-des-D-garcigerr in A (bHGA)invitro, MC3T3-E1 was treated with bHGA and the alkaline phosphatase activity, mineralization, the expression of bone-related genes and the early osteogenic differentiation-related genes of MC3T3-E1 cells were measured. The results showed that the mRNA expression ofRunx2 was generally not affected by bHGA, however, it inhibited the mRNA expression ofOsx. bHGA promoted the expression ofOCNandCol1 but inhibited the mRNA expression ofAPL.OPNexpression was not affected by bHGA. Our study demonstrated that bHGA was not conductive to the early differentitation of bone, while it might stimulate bone maturation by enhancingOCNandCol1 mRNA expression.

Keywords12b-hydroxy-des-D-garcigerrin A; osteogenic activity; bone-related genes; osteogenic differentiation-related genes

收稿日期2015-12-09

作者简介王朝元(1964-),男，教授,博士,研究方向:生物医学工程,E-mail: wangchaoyuan@mail.scuec.edu.cn

基金项目湖北省自然科学基金资助项目(2013CFB450)

中图分类号Q28

文献标识码A

文章编号1672-4321(2016)02-0031-05