产壳聚糖酶菌株的筛选与鉴定

胡远亮， 洪　文， 谭光迅

(1 湖北师范大学 食用野生植物保育与利用湖北省重点实验室，黄石 435002； 2 华中农业大学 农业微生物学国家重点实验室，武汉 430070；3 湖北枝江酒业股份有限公司，枝江 443200)



产壳聚糖酶菌株的筛选与鉴定

胡远亮1, 2， 洪文1，*， 谭光迅3

(1 湖北师范大学 食用野生植物保育与利用湖北省重点实验室，黄石 435002； 2 华中农业大学 农业微生物学国家重点实验室，武汉 430070；3 湖北枝江酒业股份有限公司，枝江 443200)

摘要从自然界中采集土壤样品，通过富集培养，平板分离，壳聚糖酶活力及粘度快速测定，获得了3 株高活力产壳聚糖酶菌株. 采用薄层层析(TLC)分析了酶解产物，结果表明：水解产物中均含有壳寡糖. 结合形态、生理生化特征鉴定及16S rDNA序列分析，初步确定其为Mitsraria(属)的一种.

关键词壳聚糖；壳聚糖酶；菌株筛选；细菌鉴定

甲壳素(Chitin)脱去55%以上N-乙酰基时，通常称之为壳聚糖(Chitosan). 甲壳素、壳聚糖在自然界中大量存在，年产量近100亿 t，是地球上含量仅次于纤维素的天然高分子化合物.

壳聚糖酶能特异性作用于壳聚糖的β- (1,4)-糖苷键，产物为低分子量的水溶性壳聚糖.水溶性壳聚糖具有良好的生物相容性、吸附性、抗菌性和抗毒性，目前已经广泛应用于农业、环保、食品、医药等领域[1].

壳聚糖酶主要存在于细菌和真菌细胞中. 近年来，研究人员已经从自然环境中筛选出并研究了Pseudomonas[2],Penicillium[3],Mmucor[4],Mitsuariachitosanitabida[5]等产壳聚糖酶菌株.本文分离出3株产壳聚糖酶高活力菌株，分析菌株的形态、生理生化特征和16S rDNA序列，进行初步鉴定.

1材料与方法

1.1主要材料、试剂及培养基配方

氨基葡萄糖(GlcN·HCl)：武汉市华顺生物技术公司；硅胶GF254：青岛海洋化工厂.

壳聚糖：粉状、不溶于水、脱乙酰度≥90%、分子量106万，国药集团.

PCR产物纯化试剂盒：美国Omega Bio-Tek；PCR 反应体系试剂：美国Promega.

胶体壳聚糖：壳聚糖1 g，0.2 mol/L的盐酸30 mL，85℃水浴10～12 h，完全溶解后，用1 mol/L NaOH缓慢调节至pH 5.0，加蒸馏水定容为1%和2%的溶液，121℃、灭菌30 min，4℃冷藏备用.

固体培养基配方：胶体壳聚糖0.5%，K2HPO40.2%，KH2PO40.1%，MgSO40.07%，NaCl 0.05%，CaCl20.01%，酵母粉0.05%，琼脂 2%，pH 6.0.

富集培养液配方：胶体壳聚糖2%，K2HPO40.2%.

液体培养基M1配方：胶体壳聚糖0.5%，KH2PO40.03%，K2HPO40.07%， MgSO40.05%，酵母粉 0.03%，蛋白胨 0.03%，pH 6.0.

液体培养基M2配方：粉状壳聚糖1%，其他与M1同.

1.2样品采集

从富含纤维质、几丁质(虾、蟹)的自然环境中采集土壤样品(如菜园，池塘污泥等)，取样袋封存，并对取样地点和土壤性质作好记录，当天稀释处理、接种进行富集培养.

1.3富集培养及平板初筛

将土壤样品，用适量无菌水溶解，取0.5 mL，加至富集培养液中，28℃、180 r/min 培养5 d. 取10-3、10-4、10-5稀释培养液，均匀涂布于胶体壳聚糖平板上，28℃恒温培养3 d，取周边有透明圈且生长良好的单菌落，点接3次(呈等边三角形)至壳聚糖平板上，培养3 d后，取出平板，测量菌落直径(d)和菌落透明圈直径(D)，用d值和D/d值为衡量指标，筛选出产壳聚糖酶能力强的菌株.

1.4复筛测定酶活力

将活化后的菌株，以1%接种至胶体壳聚糖培养液中，28℃、180 r/min培养60 h，4000 r/min离心10 min，收集上清酶液. 1%胶体壳聚糖∶酶液∶pH 4.0柠檬酸缓冲液以1∶1∶2混合，测定酶活力[6].

1.5复筛乌氏粘度计快速测定

用蒸馏水将各菌株发酵液稀释为酶活力0.5 U/mL，取1 mL，与1 mL 1%胶体壳聚糖溶液混合，37℃反应10 min，沸水浴5 min，立即用蒸馏水稀释至10 mL，用乌氏粘度计快速测定，记录流出时间Tn. 对照样：先将酶液沸水浴5 min，使酶失活，再用上述方法处理，记录时间T0. 根据根据公式ηr=Tn/T0来计算相对粘度[7].

1.6酶水解产物的薄层层析(TLC)分析

将1%胶体壳聚糖∶酶液∶pH 4.0柠檬酸缓冲液以1∶1∶2混合，反应60 min后，以1∶1加无水乙醇，4500 r/min离心10 min，取上清液，旋转浓缩15～20倍，测定还原糖含量(DNS法)，并加入适量蒸馏水，至还原糖含量为2%. 以硅胶GF254板为层析板，正丙醇∶25%氨水=2∶1为层析液，0.1%茚三酮乙醇溶液为显色剂，进行检测[8].

1.7菌株的16S rDNA序列分析

提取纯化细菌总 DNA , 上下游 PCR引物分别为P0(5′-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′) 和PC3 (5′-CTAHAGGGTATCTAATCCT-3′) . PCR程序为：预变性94℃、3 min，变性94℃、1 min，复性45℃、1 min，延伸72℃、1 min，循环30次，总延伸72℃、8 min. PCR产物采用Omega Bio-Tek试剂盒纯化回收，测序由北京奥科生物技术有限公司完成，测序引物为P0、PC3. 序列提交至GenBank 数据库进行比对. 然后运用ClustalX 2.1 进行比对分析，利用 MEGA 5.0 软件，采用Neighbor-Joining算法，构建系统发育树.

2结果与分析

2.1富集培养及平板初筛

从自然界中采集42份土壤样品，富集培养5 d观察，有19个三角瓶中的富集培养液明显变浑浊，且部分形成了密集的直径约2～4 mm的菌丝球.

产壳聚糖酶的菌株会分解壳聚糖成透明状小分子，在白色不透明的壳聚糖平板上形成了透明的水解圈. 菌株产酶活性越高，降解能力就越强，d值和D/d值就越大. 经平板分离，19个样品中，均有菌落长出. 部分菌落疏松，与霉菌特征吻合，周围有明显的不规则的透明区域. 更多菌落呈较规则的圆形，直径约1～3 mm，含水量较高，为细菌特征，个别菌落周围有较明显的透明圈. 根据菌落生长情况及透明圈大小，从中挑选10株细菌，点接种进行平板分离筛选(图1). (d值和D/d见表1)

图1　菌株在平板上的形态特征Fig.1　The morphology of bacteria strains on the plate

2.2壳聚糖酶活力及乌氏粘度计快速测定

初筛精确度不高，通过三角瓶培养测定壳聚糖酶活力进行复筛. 复筛中，培养基M1以胶体壳聚糖作为主要碳源，而培养基M2直接添加粉状壳聚糖作为碳源之一，分别考察菌株利用壳聚糖的能力(表1). 结果表明菌株141、252和282壳聚糖酶活力最高，分别为0.785、0.769、0.729 U/mL；在M1中，壳聚糖酶活力高于M2，其原因是胶体壳聚糖分子量已大大降低，菌体容易利用，生长较好，从而产酶量高. 而粉状壳聚糖，菌体生长困难，导致产酶量低.

壳聚糖酶有外切和内切之分，外切酶逐个将糖基切除，长链分子降解成低聚糖速度较慢，短时间内粘度下降不明显，而内切酶，随机切割，长链分子降解快，因此粘度降低幅度间接反映内切酶特性[7]. 为进一步考察菌株的降解能力，同时挑选壳聚糖内切酶活力高的菌株，采用乌氏粘度法测定筛选. 各菌株酶解的相对粘度见表1. 从表中可以看出，相对粘度均在0.412～0.551之间，大大降低，初步判断均具有较高的内切酶活力. 其中，菌株012、282和141降解速度最快，相对粘度分别为0.412、0.432和0.434.

表1　菌株筛选结果

综合平板分离、壳聚糖酶活力及粘度快速测定结果，菌株013、141、282产酶能力相对较强，以此3株菌作为进一步研究对象.

2.3酶解产物的TLC分析

为了进一步确定内切酶活力的存在，采用TLC分析了菌株酶解产物(图2).

(s)GlcN·HCl;(a)013;(b)141;(c)282;(d)2%胶体壳聚糖图2　 酶解产物的薄层层析分析Fig.2　TLC analysis of enzymatic hydrolysates

由图知，(d)对照样品无斑点，说明底物中不存壳寡糖或含量极低，(a)、(b)、(c)酶解样品中，在GlcN下方均有两斑点，可见样品中含二糖或以上的寡糖. 产物中并无单糖，只有寡糖，说明菌株013、141和282具内切壳聚糖酶活性.

2.4菌株形态与生理生化特征

菌株的形态及生理生化特征鉴定方法参照文献[9]. 菌株013、141、282均为G-、不产芽孢、杆状(长1.2～1.8 μm，宽0.4～0.6 μm)；典型菌落在壳聚糖平板上呈圆形、隆起，表面湿润、光滑、白色，边缘平整，周围有透明水解圈. 其形态特征和生理生化指标见表2.

表2　形态特征及生理生化指标鉴定结果

注：“+ ”表示positive ,“- ”表示negative

2.5菌株16S rDNA序列分析

比对16S rDNA序列发现，菌株013、141和282与Mitsuaria属的多株细菌相似性都达到99%以上，与该属的Mitsuariachitosanitabida(NR_040786.1)相似性为100%、100%和99%，同源性最高. 调取GenBank 数据库中代表性菌株16S rDNA序列，与菌株013、141和282的序列分析，构建进化树，结果如图3所示，这3个菌株与Mitsuariachitosanitabida3001 的亲缘关系最为接近.

图3　菌株 013、141和282的 16S rDNA 序列的系统进化树Fig.3　The phylogenetic tree of the strain 013, 141 and 282 based on 16S rDNA sequences

Mitsuaria是2005年建立的一个新属，科名未建，归属于变形菌门Proteobacteria；β-变形杆菌纲Betaproteobacteria；伯克霍尔德氏目Burkholderiales[10]. 2005年命名了该属第一个成员，模式种为Mitsuariachitosanitabida(“Mitsuaria”日本松江市的一个地名，“chitosanitabida”溶解壳聚糖之意). 该菌株为G-，不产芽孢，杆状，可分泌壳聚糖酶，该酶分子量为34 kDa. 结合文献中对Mitsuariachitosanitabida的形态学及生理生化特征描述[10,11]，初步确定3株菌归属于Mitsraria.

3结语

从自然界混杂的环境中分离出具某种特性的微生物，有很大的随机性，建立一种快速、高通量的筛选方法较为关键. 水生甲壳类动物、节肢动物和软体动物等的外壳中均富含壳聚糖. 从池塘等自然环境中采集土壤样品，唯一碳源和氮源为壳聚糖的富集培养，抑制其他微生物的生长，目标菌株在培养液占据绝对优势.为进一步增强结果的可靠性，分别以胶体壳聚糖和粉状壳聚糖作为培养基主要成分，测定酶活力，同时通过粘度快速检测壳聚糖的水解速度，并对酶解产物进行TLC初步分析，提高了筛选工作效率 . 但本方法并不适合厌氧菌，而自然界中甲壳类物质是在厌氧环境中完成降解的. 因此尽管这一筛选方案完整可靠，今后需要进一步改进完善.

变形杆菌的分类系统正在快速发展，假单胞菌属近年来被划分成为10多个属，其中至少有7个是新属[11]. 本文分离出的菌株013、141、282，与伯克霍尔德氏目的假单胞菌属比较，在形态和生理生化特征上都十分相似，进一步补充了该属的研究成果.

参考文献

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[2]王艳，周培根，俞剑燊，等．产壳聚糖酶菌株选育及培养条件优化[J]．中国海洋大学学报，2005，35(2)：293-296.

[3]王艳君，卓少玲，陈盛，等．产壳聚糖酶菌株的筛选、鉴定及酶学特性分析[J]．微生物学通报，2012, 39(12):1734-1745.

[4]温钢，刘海燕，杨梅．壳聚糖酶产生菌的选育及产酶能力研究[J]．江苏农业科学，2014，42(1)：347-349.

[5]Park J K, Shimono K, Ochiai N. Purification, characterization, and gene analysis of a chitosanase (ChoA) fromMatsuebacterchitosanotabidus3001 [J]. J Bacteriol, 1999, 181(21): 6642-6649.

[6]陈小娥，夏文水，余晓斌．壳聚糖酶高产菌株选育及发酵条件研究[J]．食品与发酵工业，2004，30(3)：66-69.

[7]冯俊丽．壳聚糖酶产生菌的鉴定及发酵条件酶学性质研究[D]．杭州：浙江大学，2004.

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[9]赵斌，何绍江．微生物学实验[M]．北京：科学出版社，2002：141-159.

[10]Amakata D, Matsuo Y, Shimono K et al. Mitsuaria chitosanotabidus gen. nov., sp. nov., an aerobic, chitosanase-producing member of the ′Betaproteobacteria′ [J]. Int J Syst Evol Microbiol, 2005, 55(5): 1927-1932.

[11]Yun C S, Matsuda H, Kawamukai M. Directed evolution to enhance secrtion efficiency and thermostability of chitosanase fromMitsuariachitosanitabida3001 [J]. Biosci Biotechnol Biochem, 2005, 70(2): 559-563.

Isolation and Identification of Chitosanase-Producing Bacterium

HuYuanliang1,2,HongWen1,TanGuangxun3

(1 Hubei Key Laboratory of Edible Wild Plants Conservation and Utilization, Hubei Normal University, Huangshi 435002, China;2 State Key Laboratory of Agricultural Microbiology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China;3 Zhijiang Liquor Industry Co. Ltd., Zhijiang 443200, China)

AbstractBased on the enrichment culture, plate isolation, determination of the activity of chitosanase and viscosity, three strains of bacteria with high chitosanase activity were isolated from soil samples. TLC analysis results showed that the chitooligosaccharides existed in the hydrolyzates of chitosan. Combined with the morphology, physiological and biochemical characterization, and 16S rDNA sequence analysis, the strains were classified intoMitsuaria.

Keywordschitosan; chitosanase; strain screening; bacterial identification

收稿日期2015-12-06通讯作者洪文(1979-),男，实验师，研究方向：微生物学与植物资源学，E-mail:whongnice@foxmail.com

作者简介胡远亮(1982-)，男，博士后、讲师，研究方向：应用微生物学，E-mail：yuanlianghu@yeah.net

基金项目湖北省自然科学基金资助项目(2015CFC797)；食用野生植物保育与利用湖北省重点实验室开放基金资助项目(EWPL201512)

中图分类号Q935

文献标识码A

文章编号1672-4321(2016)02-0042-04