坤泰胶囊对小鼠子宫内膜容受性影响的研究*

王　慧，李玉洁,陈　帆，南　燕

(新乡医学院第三附属医院妇产科，河南新乡 453003)



坤泰胶囊对小鼠子宫内膜容受性影响的研究*

王慧，李玉洁△,陈帆，南燕

(新乡医学院第三附属医院妇产科，河南新乡 453003)

[摘要]目的通过比较溶血磷脂酸受体-3(LPAR3)在小鼠胚胎着床期子宫内膜的表达，了解坤泰胶囊对小鼠子宫内膜容受性的影响。方法将90只6～8周龄的昆明雌鼠分为3组[A组：控制性超促排卵(COH)；B组：坤泰+COH；C组：生理盐水对照)，每组30只]，检查合笼次日晨阴栓，于第1～6天每天每组处死5只雌鼠，测定血清中雌二醇(E2)、孕酮(P)水平，以及腺体数和LPAR3免疫组化光密度值(IOD)。 结果A、B组血清E2、P水平值均高于同期C组(P<0.05)；HE染色，A组较B、C组腺体数明显减少(P<0.05)。A组第3天LPAR3的IOD值高于B、C组(P<0.05)，而A组第4天IOD值明显小于B、C组(P<0.05)，B组较C组略高，但差异无统计学意义(P>0.05)。结论坤泰胶囊可能通过改善COH小鼠LPAR3正常时空表达，起到改善子宫内膜容受性的作用。

[关键词]坤泰胶囊；子宫内膜容受性；控制性超促排卵；溶血磷脂酸受体-3

随着医学技术的发展，辅助生殖技术在卵子的获取、受精卵的培养、胚胎移植等方面取得很大的进步，为广大的不孕症患者带来希望；但是胚胎的着床率较前并未出现明显改善[1]，严重影响了妊娠结局，为此子宫内膜容受性即子宫内膜对胚胎的接受能力就成为当今生殖医学界研究的热点问题[2]。本实验建立了控制性超促排卵(controlled ovarian hyperstimulation，COH)小鼠模型，观察坤泰胶囊对小鼠子宫内膜容受性的影响，并了解溶血磷脂酸受体-3(lysophosphatidic acid receptors 3，LPAR3)在小鼠子宫内膜上的表达特点，对坤泰胶囊作用机制及胚胎着床影响的机制进行探讨。

1材料与方法

1.1材料清洁级昆明雌鼠90只，6～8周龄，24～34 g；雄鼠45只，8～10周龄，28～37 g，由新乡医学院实验动物中心提供。雌雄分笼饲养，自由取食水，室温22～25 ℃。

1.2方法将90只雌鼠分为A、B、C 3组(n=30)，B组给予坤泰胶囊(贵阳新天药业股份有限公司提供)，A、C组给予相同剂量生理盐水，均灌胃1个月，每只每天剂量为0.7 mL。将坤泰胶囊溶于生理盐水浓度为50 mg/mL，灌胃剂量根据许文生氏公式和Meeh-Rubner氏公式，按中国妇女的平均身高158.6 cm，体质量53.6 kg，本次实验雌鼠的平均体质量27.5 g计算，小鼠的每日灌药量约为1.2 mg/g。3组小鼠灌胃20 d后，于小鼠发情后期，A、B两组均于上午9：00腹腔注射促性腺激素释放激素拮抗剂(GnRHa)1.5 μg/100 g，连续9 d，第9天加注孕马血清促性腺激素(PMSG)10 IU/只，48 h后腹腔注射人绒毛膜促性腺激素(HCG)10 IU/只,C组同时注射同等剂量的生理盐水。HCG注射日当晚A、B、C 3组雌∶雄比2∶1合笼，次日晨7：00～8：00时检查阴栓，并记为第1天，依次为第2、3、4、5、6天，每天每组平均颈椎脱臼处死5只雌鼠，心脏取血行雌二醇(E2)、孕酮(P)测定，解剖取其子宫组织，放置4%的多聚甲醛中固定待行HE染色和免疫组化检测LPAR3表达的光密度值(IOD)。

2结果

2.13组小鼠第1～6天E2、P水平比较A、B组E2、P水平均高于同期C组，差异有统计学意义(P<0.05)；B组E2、P水平高于A组，但差异无统计学意义(P>0.05)，见表1、表2。

2.23组小鼠第4天子宫内膜HE染色比较A、B、C组腺体数分别为(12.6±3.36)、(19.8±1.92)、(17.0±2.45)个，B组腺体数高于A、C组，与A组比较差异有统计学意义(P<0.05)，与C组比较差异无统计学意义(P>0.05)。镜下观A组腺体发育差，腺腔小，间质致密，血管较少；B组腺体发育好，腺腔大，间质疏松，血管多；C、B组镜下比较无明显差别。图1～3。

2.33组小鼠LPAR3表达的IOD比较LPAR3在3组小鼠的第1～6天出现规律性表达，A组峰值出现在第3天，B、C组峰值均出现在第4天，且A组第3天的IOD值高于B、C组(P<0.05)；B、C组第4天的IOD值高于A组(P<0.05)；B组第4、5天的IOD值略高于C组，但差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。三组峰值可见免疫组化图4～6。

表1　　3组小鼠第1～6天E2水平比较

a：P<0.05，与同期C组比较。

表2　　3组小鼠第1～6天P水平比较

a：P<0.05，与同期C组比较。

表3　　3组小鼠LPAR3的IOD比较

a：P<0.05，与同期A组比较。

图1 A组第4天HE染色(×400)图2 B组第4天HE染色(×400)图3 C组第4天HE染色(×400)

图4 A组第3天LPAR3的表达(×400)图5 B组第4天LPAR3的表达(×400)图6 C组第4天LPAR3的表达(×400)

3讨论

通过提高子宫内膜容受性，从而提高辅助生殖技术的临床妊娠率是现在生殖医学界研究的热点问题，国内外学者通过大量研究以期解决超促排卵后导致的种植窗期子宫内膜容受性低下的问题，同时也是目前解决胚胎种植率低的切入点。

溶血磷脂酸(LPA)存在于机体的血清、眼房水、精浆等多种体液中，其受体有4种，分别是LPAR1、LPAR2、LPAR3、LPAR4，其中LPAR3与雌性生殖系统关系密切。有研究发现，LPAR3基因缺陷的雌性小鼠中LPAR3空间分布异常，并推测其表达异常可导致胚胎种植的延迟[3]。本实验免疫组化提示，LPAR3表达于子宫内膜上皮及腺上皮细胞质，且在子宫内膜上的表达具有规律性，3组均出现峰值，A组峰值出现在第3天，B、C组出现第4天；B组峰值高于A组，且差异有统计学意义(P<0.05)，这种规律性表达可能与生殖关系密切相关。

坤泰胶囊为纯中药制剂，由熟地黄、黄连、白芍、黄芩、茯苓、阿胶等六味中药组成，无雌激素，却有类雌激素作用。有研究证实，坤泰胶囊有雌激素样作用，并且能改善子宫内膜发育，有利于胚胎着床[4]；有研究证实，雌、孕激素在胚胎与子宫内膜对话建立关联之间起到重要的把控作用[5]。通过本实验发现坤泰胶囊确实具有升高雌、孕激素的作用，但作用弱。陈蓉等[6]研究的坤泰胶囊可以升高E2，且不会造成子宫内膜过度增生。本实验显示，坤泰胶囊同时具有改善COH引起的子宫内膜腺体少且发育不良、间质致密等作用。付连方[7]研究COH药物具有影响小鼠子宫内膜容受性，导致临床妊娠率低；龚瑜等[8]试图从子宫内膜厚度、血流指数等方面研究超促排卵对子宫内膜容受性的影响，发现超促排卵对内膜厚度与血流指数影响差异无统计学意义(P>0.05)。由本实验可见COH可能是在异常升高雌、孕激素水平，影响内膜腺体发育等方面降低子宫内膜容受性的；而坤泰胶囊在一定程度上可通过改善子宫内膜腺体少、发育不良、疏松间质从而改善COH引起的子宫内膜容受性降低；这一结论与郑瑞君等[9]研究的坤泰胶囊具有改善子宫内膜容受性的结论相同。南燕等[10]研究发现，坤泰胶囊能改善子宫内膜容受性，有助于胚胎的着床；此外宋晖等[11]研究发现，坤泰胶囊具有促排卵作用，但是不会造成子宫内膜过度增生，因此和促排卵药物联合应用可降低促排卵药物对子宫内膜的不良影响，从而达到改善子宫内膜容受性的作用。另外临床研究也证实，坤泰胶囊具有改善卵巢功能、调节雌激素水平、促进子宫内膜增生，利于胚胎着床[12-13]；还有研究显示，坤泰胶囊对更年期大鼠子宫具有营养作用[14]。

小鼠子宫内膜的种植窗为第4～5天晨，约18 h[15]。胞饮突为目前公认的子宫内膜容受性评价指标之一。郭燕红等[16]研究小鼠在合笼第4天，出现完全发育的胞饮突,本实验的B组与C组的LPAR3峰值均出现在第4天；与胞饮突的发育一致，可见LPAR3与胚胎着床确实关系密切。坤泰胶囊在改善子宫内膜腺体数少、发育不良的同时，也改善了LPAR3总体表达量，为此可见B组第4天较其他两组腺体多、LPAR3的IOD值较其他两组高，免疫组化与HE染色结果一致。为此，可推断，LPAR3与胚胎着床关系密切，其可能通过黏附作用参与胚胎着床过程。郭燕红等[16]研究表明，LPAR3在子宫内膜着床期表达，对评价子宫内膜容受性有重要意义，可作为子宫内膜容受性的良好评价指标之一。A组LPAR3峰值提前出现且较B组低，第4天腺体发育不良、间质致密、血管较少，可见COH可能导致胚胎种植窗提前，造成胚胎与子宫内膜发育不同步，而坤泰胶囊改善了COH小鼠内膜的LPAR3时空表达，并增加了LPAR3的表达量，从而起到改善小鼠子宫内膜腺体发育，提高子宫内膜容受性的作用。

坤泰胶囊能促进子宫内膜发育，并能抵制促排卵药物引起的子宫内膜容受性降低，而此作用可能是通过改善LPAR3的正常时空表达及量的表达实现；但LPAR3如何承上启下发挥调节作用尚不清楚,有待进一步研究。

参考文献

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Study on effect of Kuntai Capsule on mice endometrial receptivity*

WangHui,LiYujie△,ChenFan,NanYan

(DepartmentofObstetricsandGynecology,ThirdAffiliatedHospitalofXinxiangMedicalCollege,Xinxiang,Henan453003,China)

[Abstract]ObjectiveTo understand the effect of Kuntai Capsule on mice endometrial receptivity by comparing the lysophospholipids acid receptor-3(LPAR3) expression in endometrium during mouse embryos implantation period.MethodsNinety 6-8 week old Kunming female mice were randomly divided to three groups:the group A[controlled ovarian hyperstimulation(COH)],B (COH+Kuntai Capsule) and C(normal saline control),30 cases in each group.The vaginal plug was performed on the next day after mating.Five mice in each group were daily killed on 1-6 d.The serum estradiol(E2) and progesterone(P) levels were detected.The glands number and the immunohistochemical integrated optical density(IOD) were also determined.ResultsThe levels of serum E2 amd P in the group A and B were higher than those in the group C at the same period(P<0.05);in the HE staining,the glands number in the group A was significantly decreased compared with the group B and C(P<0.05).The IOD value of LPAR3 on 3 d in the group A was significantly lower than that in the group B and C(P<0.05),while the group B was slightly higher than the group C without statistical difference(P>0.05).ConclusionKuntai Capsule may play the role for improving the endometrial receptivity by improving the normal space-time expression of LPAR3.

[Key words]Kuntai Capsule;endometrial receptivity;controlled ovarian hyperstimulation;lysophosphatidic acid receptors 3

doi:论著·基础研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.18.005

基金项目：2012年河南省高等学校骨干教师资助项目(2012GGJS-135)。

作者简介：王慧(1987-)，住院医师，硕士研究生，主要从事子宫内膜容受性研究。△通讯作者，E-mail：645482554@qq.com。

[中图分类号]R715.9

[文献标识码]A

[文章编号]1671-8348(2016)18-2464-03

(收稿日期：2015-11-16修回日期：2016-03-08)