脑源性神经营养因子在ATP活化BV2小胶质细胞中的作用

金海祥，吴周浩

(浙江省海宁中医院麻醉科　314400)



脑源性神经营养因子在ATP活化BV2小胶质细胞中的作用

金海祥，吴周浩

(浙江省海宁中医院麻醉科314400)

[摘要]目的探讨脑源性神经营养因子(BDNF)在腺苷三磷酸(ATP)激活BV2小胶质细胞过程中的作用。方法以不同浓度ATP孵育BV2小胶质细胞后，采用Western blot法定量检测细胞中CD11b、BDNF表达水平，ELISA测定上清液中肿瘤坏死因子α(TNF-α)的分泌水平。再将BV2细胞用不同浓度BDNF清除剂原肌球蛋白相关激酶B(TrkB)/Fc预处理后给予ATP孵育，检测细胞中CD11b、BDNF表达水平的变化及上清液中TNF-α的分泌水平。最后加入外源性重组BDNF，检测细胞内CD11b表达和上清液中TNF-α的水平变化。结果ATP孵育BV2细胞后，细胞内 CD11b、BDNF及上清液中TNF-α水平在一定范围内呈剂量时间依赖性增加。加入TrkB/Fc后，BV2细胞中 CD11b、BDNF及上清液中TNF-α表达水平在一定范围内呈剂量和时间依赖性降低。加入外源性BDNF后，细胞内CD11b及上清液中TNF-α水平又出现增加。结论BV2小胶质细胞活化后细胞内BDNF增多，外源性补充BDNF可激活小胶质细胞，BDNF在小胶质细胞的活化过程中可能发挥了重要作用。

[关键词]神经病理性疼痛；BV2小胶质细胞；脑源性神经营养因子；腺苷三磷酸；原肌球蛋白相关激酶B

神经病理性疼痛(neuropathic pain，NPP)是创伤或者疾病直接累及躯体感觉神经系统后导致的疼痛，它可以继发于神经损伤、恶性肿瘤、糖尿病及缺血性疾病等。指南推荐将三环类抗抑郁药、加巴喷丁、普瑞巴林、血清去甲肾上腺素再摄取抑制剂作为一线用药，阿片类药物、曲马多作为二线药物治疗NPP。一项随机临床试验发现，只有不到50%的患者疼痛控制满意[1]。目前NPP的发生、发展及潜在调控的具体机制尚不明确。大量研究证实，NPP的与小胶质细胞活化有密切关系[2-5]。Trang等[6]发现在离体培养的小胶质细胞中腺苷三磷酸(ATP)可通过P2X4 受体激活小胶质细胞介导脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)合成和释放，并且 BDNF的合成和释放是Ca2+和p38丝裂原活化蛋白激酶(p38-MAPK)依赖的。Zhou等[7]向SD大鼠鞘内注射BDNF可通过激活小胶质细胞引起长时程增强和机械高敏。所以，离体条件下，激活的小胶质细胞可以释放BDNF促进NPP的产生，且在动物实验中应用BDNF同样能促进疼痛发生。体内条件BDNF来源广泛，神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞均可合成分泌[8-9]。关于离体条件下BDNF直接作用于小胶质细胞时小胶质细胞自身发生何种变化仍然缺乏实验研究。本研究通过设计一系列离体实验，外源加入BDNF模拟小胶质细胞分泌过程，探讨在小胶质细胞来源的BDNF和小胶质细胞活化之间是否存在一定的反馈调节机制，从而促进NPP的发生、发展。

1材料与方法

1.1主要材料与仪器BV2鼠源性小胶质细胞株购自中科院细胞资源中心，原肌球蛋白相关激酶B Fc片段(tropomyosin-related kinase B/Fc，TrkB/Fc)购自美国安迪生科技公司， ATP购自美国Sigma公司；一抗:兔抗鼠BDNF 多克隆抗体、兔抗鼠CD11b多克隆抗体购自美国 Santa公司，抗α微管蛋白α-Tubulin、抗磷酸甘油醛脱氢酶GAPDH购自美国Santa Cruz公司；二抗:辣根过氧化酶标记的山羊抗兔IgG、碳酸盐缓冲液购自美国 Santa公司，胎牛血清、伊格尔培养基DMEM购自美国Gibco公司，十二烷基硫酸钠(SDS)、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、BCA 蛋白浓度检测试剂盒购自南京碧云天公司，Tween 20、TBS购自Sigma公司，PVDF 膜购自美国Millipore 公司，脱脂奶粉购自上海光明乳业有限公司，免疫印迹化学发光试剂ECL购自美国 Santa Cruz 公司。

1.2方法

1.2.1细胞复苏从液氮罐中取出冻存BV2细胞的凉融管，直接放入37 ℃的水中水浴，快速解冻，当细胞完全解冻时，将液体移入离心管，1 000 r/min离心5 min，弃上清液，加入新鲜培养液DMEM，重悬细胞，移入培养瓶中，37 ℃、 5%CO2培养箱孵育。细胞传代：吸弃培养瓶内的DMEM，用PBS液清洗2次，然后加入1 mL 0.25%～0.02% EDTA-Trypsin，消化2～5 min，倒置显微镜观察，发现细胞质回缩、细胞间隙增大后，用吸管轻轻吹打细胞，加入离心管中，1 000 r/min离心5 min，弃上清液，加入DMEM，用吸管吹打至细胞混匀，移入培养瓶中，通常按1∶4进行传代。

1.2.2检测ATP对小胶质细胞的影响BV2细胞以相应密度接种入6孔培养板，贴壁24 h后，进行各种药物处理。采用ATP(0、10、50、500、1 000 μmol/L)处理，用蛋白免疫印迹测量BV2细胞中的CD11b、BDNF水平，用ELISA测量上清液中肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平。用500 μmol/L ATP 处理BV2细胞，于加入前及加入后15、60、120 min时用同样方法测定上述参数。观察不同剂量ATP对小胶质细胞的影响及最佳作用剂量，并观察500 μmol/L ATP不同作用时间对小胶质细胞的影响。

1.2.3检测TrkB/Fc对小胶质细胞的影响采用对照组、ATP组、TrkB/Fc、ATP+TrkB/Fc 1 μg、ATP+TrkB/Fc 5 μg、ATP+TrkB/Fc 10 μg处理60 min，其中ATP浓度为500 μmol/L，TrkB/Fc应加入培养孔中预先孵育。测定BV2细胞中的CD11b、BDNF及上清液中TNF-α水平。用ATP+TrkB/Fc 10 μg处理BV2细胞，于加入前及加入后15、60、120 min时用同样方法测定上述参数。观察不同剂量TrkB/Fc对小胶质细胞的影响及最佳作用剂量，并观察ATP+TrkB/Fc 10 μg不同作用时间对小胶质细胞的影响。

1.2.4检测BDNF对小胶质细胞的影响采用空白对照组及BDNF 1、10、100 ng 3个剂量组。测定BV2细胞中的CD11b及上清液中TNF-α水平。用BDNF处理BV2细胞，于加入前及加入后15、60、120 min时用同样方法测定上述参数。观察不同剂量BDNF对小胶质细胞的影响及最佳作用剂量，并观察BFNF 10 ng不同作用时间对小胶质细胞的影响。

1.2.5蛋白免疫印迹将上样液于10 %SDS-PAGE上进行电泳分离后，蛋白半干转入PVDF硝酸纤维膜上，将PVDF膜浸入含5%的脱脂奶粉的TBST封闭液中，置于水平摇床上，室温封闭2 h。用TBST配制一抗兔抗鼠BDNF单克隆抗体(工作浓度为1∶200)、CD11b单克隆抗体(工作浓度为1∶200)、抗α-Tubulin(工作浓度为1∶1 000)、抗GAPDH(工作浓度为1∶1 000)于4 ℃孵育18 h 后TBST清洗3次，每次5 min，再用TBST配制二抗辣根过氧化酶标记的山羊抗兔IgG(工作浓度为1∶5 000，)37 ℃孵育2 h。然后用TBST清洗3次，每次5 min。用ECL试剂盒的A液和B液各0.5 mL，混匀后与膜于室温下作用60 s，置膜片于二层保鲜膜之间，将膜片吸附蛋白面朝上，置于X光片盒中，暗室曝光。蛋白表达水平以目的蛋白与内参灰度比值表示。CD11b以为α-Tubulin内参，BDNF以GAPDH内参。

1.2.6ELISA将上清液加入酶标包被板孔，分别设空白孔、待测样品孔，在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40 μL，然后再加待测样品10 μL(样品最终稀释度为5倍)。将样品加于酶标板孔底部时尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。用封板膜封板后置37 ℃温育30 min。将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 s后弃去，如此重复5次，拍干。每孔加入酶标试剂50 μL，空白孔除外。再次按上述方法温浴，洗涤。每孔先加入显色剂A 50 μL，再加入显色剂B 50μL，轻轻振荡混匀，37 ℃避光显色15 min。每孔加终止液50 μL，终止反应。以空白空调零，450 nm波长依序测量各孔的吸光度(A值)。测定应在加终止液后15 min以内进行。

2结果

2.1ATP对小胶质细胞的影响ATP可以剂量和时间依赖性激活小胶质细胞，与对照组比较，CD11b随ATP剂量的增加而增加(P<0.01)，在500 μmol/L时CD11b分泌达高峰。用500 μmol/L等剂量的ATP孵育小胶质细胞，随时间的增加，CD11b表达逐渐增加(P<0.01)，在120 min时CD11b分泌达到高峰；与对照组比较，ATP增强小胶质细胞TNF-α的释放呈剂量和时间依赖关系(P<0.05)，见图1。在ATP激活小胶质细胞过程时BDNF水平增加，与对照组比较，BDNF随ATP剂量的增加而合成增多(P<0.01)，在剂量为500 μmol/L时合成达高峰。用500 μmol/L等剂量的ATP孵育小胶质细胞，随时间的增加，BDNF表达逐渐增加(P<0.01)，在60 min时BDNF表达达到高峰，见图2。

2.2TrkB/Fc对ATP与小胶质细胞的影响BDNF抑制剂TrkB/Fc，可以抑制ATP对小胶质细胞的活化能力。CD11b随ATP剂量的增加而减少(P<0.05)。用10 μg等剂量的TrkB/Fc孵育小胶质细胞，随时间的增加，CD11b表达逐渐减少(P<0.05)；BDNF随TrkB/Fc剂量增加而合成减少(P<0.05)，在剂量为10 μmol/L时合成被抑制最强。用10 μmol/L的TrkB/Fc孵育小胶质细胞，随时间的增加，BDNF表达逐渐减少(P<0.05)；TrkB/Fc抑制小胶质细胞TNF-α的释放呈剂量和时间依赖关系(P<0.05)，见图3。

2.3BDNF对小胶质细胞的影响加入外源性BDNF，同样可以激活小胶质细胞，与对照组比较，CD11b随BDNF剂量的增加而增加(P<0.01)，用100 ng等剂量的BDNF孵育小胶质细胞，随时间的增加，CD11b表达逐渐增加(P<0.01)；TrkB/Fc抑制小胶质细胞TNF-α的释放呈剂量和时间依赖关系(P<0.05)，见图4。

1:对照组；2：ATP 10 μmol/L组；3：ATP 50 μmol/L组；4：ATP 100 μmol/L组；5：ATP 500 μmol/L组；6：ATP 1 000 μmol/L组；Ⅰ:ATP 15 min;Ⅱ:ATP 60 min;Ⅲ:ATP 120 min。A、B：BV2小胶质细胞内 CD11b及内参α-tubulin在不同剂量ATP下和不同作用时间的Western blot条带；C、D：以CD11b和内参α-tubulin的比值量化CD11b在不同剂量ATP下和不同作用时间表达的变化；E、F：TNF-α在不同ATP剂量下和不同作用时间分泌的变化；a：P<0.01，b：P<0.05，与对照组比较。

1:对照组；2：ATP 10 μmol/L组；3：ATP 50 μmol/L组；4：ATP 100 μmol/L组；5：ATP 500 μmol/L组；6：ATP 1 000 μmol/L组；Ⅰ:ATP 15 min;Ⅱ:ATP 60 min;Ⅲ:ATP 120 min。A、B：BV2小胶质细胞内BDNF及内参GAPDH在不同ATP剂量下和不同作用时间的蛋白印记条带；C、D：以BDNF和内参GAPDH的比值量化BDNF在不同ATP剂量下和不同作用时间表达的变化；a：P<0.01，与对照组比较。

1:对照组；2：ATP组；3：TrkB/FC组；4：ATP+TrkB/FC 1 μg组；5：ATP+TrkB/FC 5 μg组；6：ATP+TrkB/FC 10 μg组；Ⅰ:ATP+FC 15 min;Ⅱ:ATP+FC 60 min;Ⅲ:ATP+FC 120 min。A、B：BV2小胶质细胞内CD11b及内参α-tubulin在不同剂量Trkb/Fc下和不同作用时间的Western blot条带；C、D： BV2小胶质细胞内BDNF及内参GAPDH在不同Trkb/Fc剂量下和不同作用时间的蛋白印记条带；E、F：以CD11b和内参α-tubulin的比值量化CD11b在不同剂量Trkb/Fc下和不同作用时间表达的变化；G、H：TNF-α在不同剂量TRkb/Fc下和不同作用时间分泌的变化；I、J：以BDNF和内参GAPDH的比值量化BDNF在不同Trkb/Fc剂量下和不同作用时间分泌的变化；a：P<0.01，b：P<0.01，与对照组比较；c：P<0.05，与ATP组比较。

1:对照组；2：BDNF 1 ng组；3：BDNF 10 ng组；4：BDNF 100 ng组；Ⅰ:BDNF 15 min;Ⅱ:BDNF 60 min;Ⅲ:BDNF 120 min。A、B：BV2小胶质细胞内CD11b及内参α-tubulin在不同剂量BDNF下和不同作用时间的Western blot条带；C、D：以CD11b和内参α-tubulin的比值量化CD11b在不同剂量BDNF下和不同作用时间表达的变化；E、F：TNF-α在不同剂量BDNF下和不同作用时间分泌的变化；a：P<0.01，b：P<0.05，与对照组比较。

3讨论

大量研究发现，小胶质细胞在NPP的起始和发展过程中发挥了重要的作用[2-5]。小胶质细胞激活后上调细胞表面受体分子、增强促炎细胞因子释放等，如CD11b[10]、TNF-α[11-12]、前列腺素及白细胞介素等，从而调控神经系统兴奋性。研究发现许多炎症因子有增强突触间递质的信号传递，并促发突触后神经元的敏化的作用[13-14]。BDNF 是神经营养因子家族的一员，它不仅促进神经元的生长和分化，还可以作为神经调质调控神经元兴奋性、突触可塑性在NPP中发挥重要的作用[15-17]。Chen 等[18]研究发现，BDNF能否增强初级传入纤维末端NMDA受体作用，增强初级传入纤维和脊髓神经元之间的突触传递。在一些病理过程中正反馈机制往往发挥重要作用，但是对于小胶质细胞合成的BDNF能否具有自分泌刺激因子功能的研究仍然缺乏。因此，本研究进行了一系列实验来确认小胶质来源的BDNF是否能够进一步通过自分泌行为加强自身活化。通过实验，本研究发现ATP可以激活BV-2小胶质细胞，使其表面标志分子CD11b上调，TNF-α分泌增多，并且在活化时发现BDNF的合成增多。加入BDNF清除剂清除TrkB/Fc后，ATP对小胶质细胞活化能力减弱，CD11b表达减少，合成BDNF减少， TNF-α分泌也减少。补充外源性BDNF，小胶质细胞再次出现活化，CD11b合成增加，TNF-α的释放增加。因此，本研究推测BDNF可能作为一种自分泌激活物在进一步促进在小胶质细胞过程中扮演着重要作用。虽然它在NPP中的详细作用机制仍需未来进行更深入的研究，但是本研究推测在疼痛药物开发中，将BDNF作为特定靶点可能有助于研发出止痛新药。随着对小胶质细胞功能认识的不断深化，也必将为治疗NPP这一困扰人类健康的难题提供更多的药物靶点和干预措施。

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Effect of brain-derived neurotrophic factor on BV2 microglia activated by ATP

JinHaixiang,WuZhouhao

(DepartmentofAnesthesiology,HainingMunicipalHospitalofTraditionalChineseMedicine,Haining,Zhejiang314400,China)

[Abstract]ObjectiveTo study the effect of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) in the process of adenosine triphosphate (ATP) activating BV2 microglia.MethodsBV2 microglia was cultured by adding different concentrations of ATP.Then the expression level of intracellular CD11b and BDNF and the secretion level of TNF-α in the supernatant were quantitatively determined by Western blot.BV2 microglia was treated by different concentrations of BDNF scavenger tyrosine kinase receptors B (TrkB)/Fc and incubated by ATP.The expression level of intracellular CD11b and BDNF and the secretion level of TNF-α in the supernatant were measured.Finally adding exogenous recombinant BDNF into cultured BV2 microglia,intracellular changes of CD11b and supernatant TNF-α levels were detected.ResultsAfter adding ATP for cultivating BV2 microglia,intracellular CD11b and BDNF expression levels and supernatant TNF-α level were increased with a dose- and time-dependent manner in some ranges.After adding TrkB/Fc,the levels of intracellular CD11b and BDNF expression and supernatant TNF-α level were decreased with a dose-and time-dependent manner in some range.CD11b and BDNF expression levels was decreased in a dose- and time-dependent manner.Adding exogenous BDNF,the levels of intracellular CD11b and BDNF expression and supernatant TNF-α level were increased again.ConclusionIntracellular BDNF expression is increased when BV2 microglia is activated and replenishing exogenous BDNF can activate microglia.Therefore BDNF may play an important role in the microglia activation process.

[Key words]neuropathic pain;BV2 microglia;brain-derived neurotrophic factor;adenosine triphosphate;tyrosine kinase receptor B

doi:论著·基础研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.18.006

作者简介：金海祥(1975-)，副主任医师，本科，主要从事麻醉和疼痛的基础与临床研究。

[中图分类号]R338.3

[文献标识码]A

[文章编号]1671-8348(2016)18-2467-04

(收稿日期：2015-12-05修回日期：2016-03-16)