宣酒小窖芝麻香型白酒蒸馏过程中四甲基吡嗪的研究

司冠儒，张温清，，梅　婕，叶　明，汪家胜，周　萍（.安徽宣酒集团股份有限公司，江南小窖酿造工艺研究所，安徽宣城4000；.合肥工业大学，生物和食品工程学院，安徽合肥30000）



宣酒小窖芝麻香型白酒蒸馏过程中四甲基吡嗪的研究

司冠儒1，张温清1，2，梅婕1，叶明2，汪家胜1，周萍1
（1.安徽宣酒集团股份有限公司，江南小窖酿造工艺研究所，安徽宣城242000；2.合肥工业大学，生物和食品工程学院，安徽合肥230000）

摘要：建立了一种快速简便定量白酒中四甲基吡嗪（TMP）的高效液相色谱-质谱（HPLC-MS/MS）检测方法，并对宣酒小窖芝麻香型白酒蒸馏过程中不同层次馏分酒TMP含量的变化规律进行了分析研究。实验结果表明，该方法相关系数R2为0.9983，检测限为0.25 μg/L，定量限为0.85 μg/L，在不同样品中的回收率为92%～104%，相对标准偏差为0.51%～3.26%，该方法简单、快速、灵敏、准确度高，满足白酒中TMP的检测要求。宣酒小窖芝麻香型白酒不同层次糟醅馏分酒中TMP变化规律明显，丢糟中含量最高，中糟中最低；各馏分酒中TMP含量随蒸馏时间的延长呈不断上升的趋势。快速分析芝麻香型白酒蒸馏过程中TMP含量的变化规律，为量质摘酒、提高酒质提供了依据。

关键词：宣酒；四甲基吡嗪；芝麻香；蒸馏；白酒

优先数字出版时间：2016-03-24；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160324.1215.006.html。

四甲基吡嗪（tetramethylpyrazine，TMP），又名川芎嗪，是一种常见的烷基吡嗪类化合物，广泛存在于食品原料、加工食品和酒精饮料中，具有坚果、焙烤和烘烤的香气［1-2］。在中国传统白酒中亦检测到一定量的TMP，TMP具有较低的风味阈值，因此被认为对中国酱香型和芝麻香型白酒的风味有重要的贡献。TMP作为中药材川芎（Ligusticum wallichii）根茎的主要活性生物碱成分，已被大量研究证明具有扩张血管、改善微循环、抑制血小板集聚、保肝护肝等临床药理作用［3-6］，这赋予了中国白酒有益健康的功能。

色谱是一种快速、高效的分离技术，但不能对分离出的每个组分进行鉴定；质谱是一种重要的定性鉴定和结构分析的方法，是一种高灵敏度、高效的定性分析工具，但没有分离能力，不能直接分析混合物。将两者结合起来，把质谱仪作为色谱仪的检测器将能发挥两者的优点，具有色谱的高分辨率和质谱的高灵敏度。色谱质谱联用技术是分析化学发展最快、应用最广的分析方法之一。直接进样法是样品进行简单处理或者不处理而直接分析的一种方法。该方法操作简单、重复率好、稳定性高。本研究基于色谱质谱联用技术与直接进样法，在前期以气相色谱与液相色谱分析研究四甲基吡嗪的基础上［7-8］，将HPLC-MS/MS技术应用于白酒中四甲基吡嗪的检测，并对发酵过程中不同层次糟醅蒸馏过程中TMP的规律进行研究，以期指导生产富含健康因子四甲基吡嗪的白酒工艺的研发。

1材料与方法

1.1材料、试剂与仪器

酒样：白酒样品为本公司所产原酒。

仪器设备：液相色谱-质谱联用仪（HPLC-MS/MS 1260-6460）、色谱柱（ZORBAX Eclipse Plus C18Rapid Resolution 4.6 x 100 mm 3.5-Micron），美国安捷伦公司；超纯水仪（A2S-10-CE），美国艾科浦国际有限公司。

试剂及耗材：四甲基吡嗪标准物质（TMP），美国西格玛-奥德里奇公司；甲酸（色谱纯）、乙醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）上海安谱科学仪器有限公司；超纯水由实验室超纯水仪制备。

1.2实验方法

1.2.1取样方法的确定及样品前处理

将不同发酵层次糟醅及其馏分酒进行取样，每2min 取1个样备用。白酒样品过0.22μm有机滤膜，取过滤后样品约1mL于液相样品瓶中，供HPLC-MS/MS分析用。

小窖池中糟醅层次从上到下依次为丢糟、面糟、中糟、底糟，其中，面糟蒸馏后摊晾拌曲为下一轮丢糟。

1.2.2标准溶液的配制

准确称取四甲基吡嗪标准物0.1 g（精确到0.001 g）于100mL容量瓶中，用60%乙醇定容至刻度，制成浓度为1000 mg/L的四甲基吡嗪标准储备液；取1mL四甲基吡嗪储备液至100mL容量瓶中，用60%乙醇定容至刻度，制成浓度为10 mg/L的四甲基吡嗪标准使用液。

1.2.3标准曲线的绘制

分别取0、0.25mL、0.5mL、1.0mL、2.0mL、4.0mL、8.0mL四甲基吡嗪标准使用液于10mL容量瓶中，用60%乙醇定容至刻度，制成浓度分别为0、0.25 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L、4.0 mg/L、8.0 mg/L的四甲基吡嗪标准溶液系列。按照1.2.1方法进行前处理，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制四甲基吡嗪标准曲线，外标法定量。

1.2.4 HPLC-MS/MS方法

HPLC条件：流动相，乙腈∶0.1%甲酸=35∶65；流速0.4mL/min；柱温35℃。

MS/MS条件：干燥气流速11 L/min；干燥气温度350℃；雾化器压力50 psi；质谱模式MRM（多反应检测），具体参数见表1。

2结果与讨论

2.1分析条件的确定

本实验室前期已开发了一种检测四甲基吡嗪的液相色谱方法［8］，本实验HPLC条件部分参考了该方法，基于ESI+对流动相的要求，在水相中加入0.1%甲酸，以利于四甲基吡嗪的离子化，最终确定流动相组成为乙腈∶0.1%甲酸=35∶65，四甲基吡嗪的响应值与分离度均较好，同时保留时间也较短；MS/MS方法参数部分，裂解电压（Fragmentor Voltage）主要影响毛细管末端进入MS1的母离子的丰度，碰撞能（Collision Energy）主要影响碰撞池中产生的子离子的丰度，本实验着重对2个参数进行了优化，最后确定的MRM参数见表1。该分析条件下，四甲基吡嗪标准样品的色谱图和质谱图见图1。

表1 MRM检测参数表

图1四甲基吡嗪标准样品的色谱图和MRM质谱图

2.2方法的精确性和精密度

表2为采用本方法定量白酒中TMP的线性、检出限和定量限。由表2可知，该方法有较宽的TMP检测线性范围，在0.25～8.0 mg/L之间线性关系较好，线性相关性系数R2为0.9983。以3倍信噪比为标准，计算该方法的检出限，以10倍信噪比为标准，计算其定量限。结果表明，检出限和定量限分别为0.25 μg/L和0.85 μg/L。

在不同种类的白酒样品中添加标准品，计算回收率，并通过重复性实验检验该方法的相对标准偏差。由表3可知，该方法检测不同种类白酒中TMP的回收率在92%～104%之间，相对标准偏差在0.51%～3.26%之间，可见该方法对于TMP的检测具有较高的准确性和精确性，能够满足白酒中TMP的分析检测要求。

表2 TMP定量方法的线性、检测限和定量限

表3 TMP定量方法的精密度（n=6）和回收率

2.3芝麻香白酒TMP在蒸馏过程中的含量变化

在上述建立的TMP检测方法的基础上，对本厂所产芝麻香型白酒不同层次糟醅及其馏分酒按1.2.1方法进行取样、分析，所得结果见图2。由图2可知，各层次糟醅馏分酒中TMP的含量从2min以后，随时间的延长呈逐渐上升趋势，而0min时的含量略高于2min。出现这种情况的原因是0min所馏出的酒含有上一甑的残留，而整个馏酒过程，后段TMP的浓度远大于前段的浓度，所以0min浓度略高于2min浓度。四甲基吡嗪含量随蒸馏时间的延长逐渐上升，这一趋势与吴建锋研究芝麻香蒸馏过程中吡嗪的变化规律是一致的，但吴的研究并未对不同层次糟醅中四甲基吡嗪的含量进行分析研究［9］。依据高传强与谭光迅的研究结果［10-11］，白酒中的四甲基吡嗪在蒸馏和储藏阶段的产生途径主要为美拉德反应，在蒸馏阶段后期，由于美拉德反应作用时间比前段时间长，所以四甲基吡嗪的含量随着蒸馏时间的延长逐渐升高。

图2芝麻香型白酒蒸馏过程中TMP含量的变化

各层次糟醅馏分酒之间，四甲基吡嗪含量以丟糟中最高，面糟其次，中糟最低。根据文献报道［9，12］，TMP在发酵阶段的产生途径主要是美拉德反应和细菌代谢，从面糟到底糟中氧气含量逐渐减少，所以面糟中微生物有氧代谢最旺盛，产热最强，从而温度最高，更有利于美拉德反应；同时高温也更有利于细菌利用乙偶姻产生四甲基吡嗪，所以面糟中TMP含量最高；底糟与窖泥接触最充分，细菌代谢较为旺盛，所以底糟中含量略高于中糟；而丟糟中营养物质含量低于面糟，微生物种群数量受到一定的限制，但丢糟经2轮次的发酵，可能其中四甲基吡嗪的前体物质积累较多，所以丢糟中含量略高于面糟，具体原因还有待进一步研究。

3　结论

基于HPLC-MS/MS技术，本研究建立了快速、简便、准确检测白酒中四甲基吡嗪的方法，该方法前处理简单，稳定性、重现性、精确性均较好，能够满足白酒厂对四甲基吡嗪的日常检测要求。并对芝麻香型白酒不同发酵层次糟醅蒸馏过程中TMP的含量进行分析研究，其在整个蒸馏过程和不同层次糟醅的分布规律明显，TMP随着蒸馏时间的延长含量逐渐增高，且在窖池中随着层次糟醅的深入，含量依次变化，呈“面糟＞底糟＞中糟”趋势。为指导研究小窖芝麻香酿造工艺特点、皖南特有酿造功能微生物及丰富宣酒酒体中TMP的工艺改进，提供了一定的理论和实践基础。

参考文献：

［1］Masuda H，Mihara S.Olfactive properties of alkylpyrazines and 3-substituted 2-alkylpyrazines［J］.Journal of Agricultural & Food Chemistry，2002，36（3）：584-587.

［2］Fan W L，Xu Y，Zhang Y H.Characterization of pyrazines in some Chinese liquors and their approximate concentrations［J］.Journal of Agricultural & Food Chemistry，2007，55（24）：9956-9962.

［3］Jones J H，Bicking J B，Cragoe E J.Pyrazine diuretics.IV.N-amidino-3-amino-6-substituted pyrazinecarboxamides［J］.J Med Chem，1967（5）：899-903.

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［7］张温清，王永军，饶志明，等.宣酒芝麻香型白酒中吡嗪类健康功能因子的分析研究［J］.酿酒科技，2014（8）：37-39.

［8］司冠儒，张温清，张显，等.HPLC快速检测芝麻香型白酒中四甲基吡嗪［J］.酿酒，2014，41（5）：89-91.

［9］吴建峰.白酒中四甲基吡嗪全程代谢机理研究［D］.无锡：江南大学，2013.

［10］高传强.美拉德反应产物对芝麻香典型风格形成的影响［J］.酿酒科技，2010（1）：53-56.

［11］谭光迅，韩兴林，李建飞，等.蒸馏过程中的美拉德反应［J］.酿酒科技，2010（11）：61-64.

［12］徐岩，吴群，范文来，等.中国白酒中四甲基吡嗪的微生物产生途径的发现与证实［J］.酿酒科技，2011（7）：37-40.

Rapid Detection of Tetramethylpyrazine in Small-Pit Zhimaxiang Baijiu During the Distillation

SI Guanru1，ZHANG Wenqing1，2，MEI Jie1，YE Ming2，WANG Jiasheng1and ZHOU Ping1
（1.Jiangnan Istitute of Small Pit Brewing Technology，Xuanjiu Group Co.Ltd.，Xuancheng，Anhui 242000；2.College of Biotechnology and Food Engineering，Hefei University of Technology，Hefei，Anhui 230000，China）

Abstract:A rapid detection method of tetramethylpyrazine（TMP）in Baijiu by HPLC-MS/MS had been developed，which was used to detect TMP content in different distillate during the distillation of Zhimaxiang Baijiu.The experimental results showed that such method had good linear relationships（R2=0.9983 and detection limit=0.25 μg/L）with its quantitative limit as 0.85 μg/L.The relative standard deviation was between 0.51%-3.26%and the recovery was within 92%-104%.The method was simple，rapid，sensitive and precise.It was suitable for the detection of TMP in Baijiu.There was significant difference in TMP content in different distillate during the distillation of Zhimaxiang Baijiu （TMP content the highest in waste fermented grains and the lowest in medium fermented grains）.Besides，TMP content increased with distillation time.The analytic results provided theoretical evidence for improving liquor quality and liquor-receiving according to quality.

Key words:Xuanjiu；tetramethylpyrazine；Zhimaxiang Baijiu；distillation；Baijiu

中图分类号：TS262.3；TS261.4；TS261.7

文献标识码：A

文章编号：1001-9286（2016）06-0075-03

DOI：10.13746/j.njkj.2016026

收稿日期：2016-01-20

作者简介：司冠儒，男，硕士，工程师，研究方向：酿酒微生物及白酒风味物质研究；张温清，男，博士在读，工程师。

通讯作者：周萍，女，工程师，高级检验师，省白酒评委，安徽宣酒集团食品安全总监；叶明，男，教授，博导，合肥工业大学生物工程系主任。